APP外膜脂蛋白基因克隆、原核表达及免疫原性初步研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是革兰氏阴性无芽胞的短杆菌,目前已发现15个血清型。APP可以起猪的传染性胸膜肺炎（Porcineinfectious pleuropneumonia）。该病以呼吸困难、肺出血性坏死和纤维素性粘连为主要特征,死亡率较高,易与其它病原微生物混合感染。APP的是一种多毒力因子病原,其毒力因子很多,现已发现与APP的致病性有关的毒力因子包括荚膜多糖（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、外膜脂蛋白（OMLA）、转铁结合蛋白（TBP）、溶血外毒素（Apx）、蛋白酶、渗透因子、粘附因子、菌毛、尿素酶等。根据GenBank基因序列号为U86675血清型1型APP OMLA基因序列,设计并合成了特异性引物,采用PCR技术,以APP细菌DNA为模板,扩增出OMLA基因,将基因连接到pMD18-T载体上并测序,测序结果表明其开放阅读框有1095个碱基,编码364个氨基酸。将OMLA基因核苷酸序列及推导氨基酸序列与其他已报道的OMLA基因进行同源性比较、变异分析,结果显示,OMLA基因核苷酸序列与1型、9型和11型同源性为100%,与2型、3型、4型同源性分别为76.2%、63.3%、63.8%,与5型、6型、7型同源性分别为62.5%、63.3%和64.4%,与8型、10型和12型同源性分别为77.3%、62.2%和98.6%。OMLA基因编码的氨基酸序列与1型、9型和11型同源性为100%,与其他血清型同源性分别为62.2～98.6%。以pMD18-OMLA为模板,扩增出成熟蛋白的编码基因（1032bp）,并将其插入pET-32a（+）表达质粒,构建了pET32a（+）-mOMLA成熟蛋白原核表达质粒。阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达重组成熟蛋白,SDS-PAGE,Western-blot证实表达出60kD左右的融合蛋白,并检测其可溶性。试验确定OMLA重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.4mmol/L,37℃诱导培养4h,在最佳表达条件下,重组成熟蛋白表达的相对含量可达到47.5%。重组成熟蛋白纯化复性后,分别以重组蛋白、重组蛋白与灭活APP、灭活APP以及PBS与等量的佐剂乳化后免疫小鼠,期间用间接ELISA方法检测抗体效价,在免疫三次后,用5×LD50的APP血清1型菌对小鼠进行攻毒。结果表明,重组蛋白具有一定的免疫原性,可刺激机体产生较高水平的抗体（＞1:3200）,免疫后的试验动物对同型APP的感染具有一定的保护力。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎的传播途径
• 1.2 传染性胸膜肺炎的危害
• 1.3 猪传染性胸膜肺炎病原学
• 1.3.1 胸膜肺炎放线杆菌分类、理化性质及生长特性
• 1.3.2 胸膜肺炎放线杆菌抗原与血清型
• 1.3.3 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子致病性及免疫原性研究进展
• 1.3.4 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌致病机理
• 1.4 猪传染性胸膜肺炎临床症状
• 1.5 猪传染性胸膜肺炎病理学特征
• 1.6 猪传染性胸膜肺炎的诊断方法研究进展
• 1.6.1 病原学诊断方法
• 1.6.2 血清学诊断方法
• 1.7 APP疫苗研究
• 1.7.1 灭活苗
• 1.7.2 亚单位疫苗
• 1.7.3 弱毒活疫
• 1.7.4 噬菌体疫苗
• 1.7.5 口服疫苗
• 1.8 猪传染性胸膜肺炎防治
• 1.9 研究外膜脂蛋白的意义
• 第二章 APP外膜脂蛋白的克隆和序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 酶和试剂盒
• 2.1.3 主要培养基
• 2.1.4 主要药品与试剂
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.1.6 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 APP细菌DNA的提取
• 2.2.2 PCR扩增OMLA基因
• 2.2.3 APP OMLA基因克隆与测序
• 2.2.4 APP OMLA基因生物信息学分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 OMLA基因PCR产物
• 2.3.2 pMD18-T-OMLA重组质粒的PCR鉴定
• 2.3.3 pMD18-T-OMLA重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.4 pMD18-T-OMLA重组质粒的序列测定
• 2.3.5 APP SC-A株OMLA基因生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 OMLA成熟蛋白的原核表达及免疫原性研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株和载体
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 溶液配制
• 3.1.4 实验动物
• 3.2 方法
• 3.2.1 OMLA成熟蛋白的表达和纯化
• 3.2.1.1 OMLA成熟蛋白基因扩增与克隆载体的构建
• 3.2.1.2 OMLA成熟蛋白基因重组表达质粒的构建
• 3.2.1.3 OMLA成熟蛋白基因重组表达质粒的诱导表达
• 3.2.1.4 OMLA成熟蛋白原核表达条件的优化
• 3.2.1.5 OMLA重组成熟蛋白的Western-blot鉴定
• 3.2.2 OMLA重组蛋白免疫原性研究
• 3.3 结果
• 3.3.1 OMLA成熟蛋白基因扩增及克隆、表达载体的构建
• 3.3.2 OMLA重组成熟蛋白的诱导表达和可溶性检测
• 3.3.3 OMLA重组成熟蛋白的表达条件的优化
• 3.3.4 OMLA重组成熟蛋白Western-blot鉴定
• 3.3.5 OMLA重组蛋白的纯化
• 50)的确定'>3.3.6 APP1型菌的半数致死量(LD₅₀)的确定
• 3.3.7 OMLA表达蛋白的最适包被浓度和待检测血清稀释度的确定
• 3.3.8 抗体检测
• 3.3.9 攻毒结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于OMLA
• 3.4.2 关于原核表达系统
• 3.4.3 关于信号肽
• 3.4.4 关于非变性电泳纯化蛋白质
• 3.4.5 关于包涵体
• 3.4.6 抗原,抗体最适浓度的测定
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的论文