SLAⅠ类经典基因多态性及正选择检验分析

论文摘要

主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex,MHC）指集中于某一染色体、编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因群。MHCⅠ类基因主要编码MHCⅠ类分子,负责内源性抗原递呈,与动物机体的免疫应答密切相关,在移植排斥反应中起重要作用,在人和鼠上已经开展了大量研究。本文以从江香猪及大花白猪为研究对象,运用RT-PCR、克隆菌液PCR-SSCP、挑选克隆子测序等方法研究了三个SLAⅠ类基因外显子2、3的多态性,并在此基础上分析其进化选择机制。通过SLAⅠ类基因单个氨基酸位点正选择检验分析来推测可能存在的ARS位点,为SLAⅠ类基因多态性、适应性进化及抗原递呈功能性的研究提供理论基础,主要结果如下:1.通过与网上已有的SLAⅠ类基因对比分析,在从江香猪及大花白猪测序得到的222条序列中共发现53个SLA-1新等位基因,30个SLA-2新等位基因,31个SLA-3新等位基因,GenBank上有12个等位基因在本试验得到验证。按照国际动物遗传学会（ISAG）2004年制定的SLAⅠ类基因系统命名法要求进行了系统命名,建立了等位基因间系统进化树。2.三个SLA经典Ⅰ类基因的外显子2、3具有高度多态性,在氨基酸水平从江香猪SLA-1、SLA-2完整外显子2、大部分外显子3编码的169个氨基酸序列中变异位点分别有71个（57P+14S）、64个（50P+14S）,SLA-3完整外显子2、3编码的182个氨基酸序列中变异位点有75个（55P+20S）。SLA-3*0702dh01在CDS序列第238、239位间有9个碱基的插入（AGTGGCAGG）;SLA-3*05dh01在CDS序列第881、882位间有3个碱基的插入（TGT）;未发现如等位基因SLA-3*04sc19（AY135586）在CDS序列第507、511位间有3个碱基缺失的情况。大花白猪中发现有第6外显子缺失SLA-1等位基因;从江香猪和大花白猪都发现有第6外显子缺失的SLA-3等位基因。3.三个基因外显子2、3核苷酸含量高低都依次为G＞C＞A＞T,三个基因间第一、二、三位密码子的碱基含量相近,第三位密码子偏向富含GC,G+C的含量（87.6%）远远高于A+T的含量（12.4%）。三个基因总体上来看颠换大于转换,4种颠换T—A、T—G、A—C、C—G发生的次数相近,而C—T转换数明显小于A—G转换数。三个SLA经典Ⅰ类基因外显子2、3各位密码子碱基替换情况不同,SLA-1密码子第二位发生的替换数最多,第一位其次,第三位最少;SLA-2、SLA-3密码子第一位替换数最多,第二位其次,第三位最少。3个基因在密码子第二位的转换/颠换比值最高,第一、三位则相近。4.从江香猪、大花白猪SLAⅠ类分子与HLAⅠ类分子中NK细胞受体的配体序列比较发现缺乏与NK细胞受体结合的关键氨基酸残基序列;与HLAⅠ类分子α1功能区相比较具有相同的与人CD8分子识别结合的关键氨基酸残基序列,其它在第119、121、123、126、127位存在变异。与HLAⅠ类分子α2功能区参与CD8分子识别结合的关键氨基酸残基序列相比有两个关键氨基酸残基发生变异:Ala-223-Val、Ala-235-Lys,在其余多个非关键氨基酸残基位置也都有变异。5.在SLA-1和SLA-2的外显子2、3整体分别检测到极显著和显著的正选择,而SLA-3外显子2、3无正选择（P＞0.05）。SLA-1的外显子2和外显子3都有正选择（0.01＜P＜0.05）。SLA-2外显子2无正选择但外显子3有正选择（0.01＜P＜0.05）。分别对三个基因外显子2和外显子3的α螺旋区、β折叠区进行正选择检验,结果检测到有正选择的包括SLA-1外显子2（P＜0.01）和外显子3的α螺旋区（0.01＜P＜0.05）,SLA-2外显子3的α螺旋区（0.01＜P＜0.05）以及SLA-3外显子2的α螺旋区（0.01＜P＜0.05）。三个基因外显子2、3中的β折叠区都未检测到显著的正选择（P＞0.05）。分别检验外显子2、3中抗原结合槽（Binding cleft）、T细胞受体结合区（TCR directed）、外侧氨基酸残基区以及非ARS区的正选择,结果只在按抗原结合槽检测到正选择（P＜0.01）。6.综合SLA-1、SLA-2、SLA-3基因单个氨基酸位点正选择检验结果来看,SLA经典Ⅰ类分子中正选择位点有23个:24、54、62、66、67、73、75、77、79、95、97、114、116、124、138、147、151、152、155、156、163、167、169,除了54、79、124、138位点外其余19个位点在HLA经典Ⅰ类分子中都属于ARS位点。其中6个（66、73、75、147、155、169）在HLAⅠ类分子中未检测到正选择作用,很可能也是作为ARS位点存在。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 SLA Ⅰ类基因研究新进展
• 1.1.1 SLA Ⅰ类基因结构和功能
• 1.1.2 SLA Ⅰ类基因的表达研究
• 1.1.3 SLA Ⅰ类基因分型研究
• 1.1.4 SLA Ⅰ类基因多态性研究
• 1.1.5 进化研究
• 1.1.6 展望
• 1.2 达尔文正向选择检验
• 1.2.1 针对不同的功能区域进行检验
• 1.2.2 针对基因中不同的位点进行检验
• 1.2.3 展望
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验群体
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒
• 2.1.4 所用溶液及其配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 RNA的提取
• 2.2.3 RT-PCR
• 2.2.4 cDNA的克隆及鉴定
• 2.2.5 单链构象多态性SSCP
• 2.3 数据分析
• 2.3.1 序列分析
• 2.3.2 等位基因间系统进化分析
• 3 结果与分析
• 3.1 血样总RNA的提取
• 3.2 RT-PCR
• 3.3 重组菌液PCR鉴定
• 3.4 菌液PCR-SSCP
• 3.5 序列分析及新等位基因命名
• 3.5.1 序列的整理与分析
• 3.5.2 等位基因进化分析及系统命名
• 3.6 SLA-1、SLA-2、SLA-3分子肽结合区mRNA序列的变异
• 3.6.1 mRNA序列多态位点
• 3.6.2 序列的核苷酸含量分析及转换/颠换比值
• 3.7 氨基酸序列多态性分析
• 3.7.1 氨基酸的组成含量分析
• 3.7.2 氨基酸位点多态性分析
• 3.7.3 与HLA Ⅰ类分子中NK细胞受体的配体序列及结合人CD8分子的序列比较
• 3.7.4 密码子的使用频率及偏向
• 3.8 正选择检验分析
• 3.8.1 对各结构、功能区域正选择检验（距离法）
• 3.8.2 单个氨基酸位点正选择检验
• 4 讨论
• 4.1 外显子2、3多态性研究和可疑序列
• 4.1.1 外显子2、3多态性研究
• 4.1.2 可疑序列
• 4.2 等位基因的命名
• 4.3 基因的复制
• 4.4 SLA Ⅰ类基因正向选择机制及正选择检验
• 4.4.1 按结构、功能区域进行正选择检验
• 4.4.2 单个氨基酸位点正选择检验
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 简历