PPARs筛选模型的构建及抗糖尿病天然药物活性成分的筛选

论文摘要

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）与糖尿病等代谢疾病在内的慢性疾病密切相关。现有的PPARs激动剂包括天然激动剂和合成激动剂。由于人工合成的激动剂，尤其是单靶点的PPARγ配体药物，不断显现出严重的毒副作用，现急需寻找低毒、高效的PPARs泛激动剂。而天然药物尤其是中药，多年来都发挥着治疗和预防疾病的重要作用，且具有可长期服用的特点，使得从天然药物中筛选新型的PPARs泛激动剂，成为开发治疗糖尿病及其相关并发症药物的研究热点。本研究以PPARα, PPARβ和PPARγ作为靶点，首次从12种具有治疗糖尿病作用的天然药物中，筛选出了PPARs活性部位及成分，是对其药物作用机理的补充和阐明，为这些天然药物的现代化发展，及糖尿病新药的研制奠定了基础。首先，为能有效的从天然药物中筛选出PPARs激动剂，在细胞水平上建立了以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的高通量筛选模型。将重组质粒pBIND-PPAR（α、β或γ）-LBD与报告基因pGL4.35，共同转入HeLa细胞中，以PPARs的激动剂作为阳性对照（PPARα：非诺贝特；PPARβ：L165041；PPARγ：罗格列酮），通过测定荧光酶素的表达率，确定了PPARs筛选实验的条件。同时，首次引入Z′-因子对以PPARα, PPARβ或PPARγ为靶点的细胞模型进行评价。证实本研究在HeLa细胞上，构建了一种简单、稳定、有效的和多靶点的高通量筛选模型，可用于筛选PPARs泛激动剂、双激动剂或单激动剂。接着，制备天然药物的提取物。用不同极性的溶剂，正己烷、70%乙醇、乙酸乙酯和蒸馏水为溶剂，依次对12种具有治疗糖尿病作用的天然药物（川黄连、女贞子、猪牙皂、广西山楂、石斛、桑叶、丹参、泽泻、林檎叶、绿萝花、翼首草和灰兜巴）进行全成分提取，最终获得58个提取物。为明确这12种天然药物的PPARs活性部位，用构建好的PPARs高通量筛选模型，对58个提取物先开展了PPARγ和PPARβ的活性筛选试验。证实12种药物的提取物中，只有泽泻对PPARγ或PPARβ均无激活作用；而58个提取物中共有26个提取物对PPARγ和PPARβ同时具有激活作用。其中有3个提取物，即绿萝花的乙酸乙酯萃取物（EB1）和正己烷提取物（EA）、翼首草的EA，在测试的浓度范围内，对PPARγ和PPARβ的最高激活倍数，均高于阳性对照的激活能力。根据上述活性实验结果，对其中10个具有PPARγ/β高活性的提取物，进一步开展PPARα活性实验，以期找到PPARs泛激动部位。结果表明，这10个提取物对PPARα均有激活作用，激活能力的强弱顺序为（相对于同批次阳性药的比值）：翼首草EA＞绿萝花EB1＞猪牙皂EB1＞绿萝花EA＞林檎叶水提物上清液部分（EC）＞翼首草EB3＞翼首草EB1＞林檎叶EB1＞翼首草EC＞川黄连EB1。这5种天然药物很可能是通过激活PPARs来发挥降糖、降脂和抗炎作用的。在此，本研究首次发现，天然药物的大极性提取物，即林檎叶的EC部分对PPARβ和PPARα；翼首草的EC对PPARγ和PPARα，具有明显的激活作用，激活倍数甚至高于同批次的阳性药物。然后，为确定PPARs高活性提取物中是否含有PPARs泛激动剂，对部分二级组分和单体化合物进行了活性实验。结果表明：（1）从绿萝花EB1中获得的11个二级组分，均能激活PPARγ和PPARβ；（2）首次发现，来自绿萝花EB1的9个单体化合物中，伞形花内酯和十五烷酸对PPARγ和PPARβ同时表现出激活作用，最高激活倍数分别是1.78倍和1.92倍，及1.74倍和5.91倍；（3）首次在细胞水平上证实，小檗碱是PPARs的泛激动剂；最后，对具有PPARs活性的10个提取物、绿萝花EB1的11个二级组分，及3个单体化合物的细胞毒性进行了初步探讨。MTT实验结果表明，有5个提取物（绿萝花的EA和EB1、翼首草的EB3、林檎叶的EC和猪牙皂的EB1），以及绿萝花EB1的11个二级组分和单体化合物（伞形花内酯和十五烷酸）在获得PPARs最高激活倍数下的作用浓度，均不会抑制ECV-304细胞和RAW264.7细胞的增殖；另外5个提取物，除了翼首草的EA部分和黄连的EB1部分，其他3个活性部位（林檎叶EB1、翼首草的EB1和EC）对这两种细胞增殖的抑制率均低于30.0%；小檗碱对这两种细胞的抑制率则分别为21.9%和31.3%。综上所述，本文在HeLa细胞上构建了一种以PPARα/β/γ为靶点的高通量筛选模型，能有效地从成分复杂的天然药物中筛选和评价出具有PPARs活性的部位及单体化合物。为开发可用于治疗糖尿病及其并发症的新型、安全和高效的天然药物提供了理论和实验依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 中英文缩写一览表
• 1 绪论
• 1.1 糖尿病及其相关药物的研究现状
• 1.2 PPARs 的概述
• 1.2.1 PPARs 的发现及其结构、分型和分布
• 1.2.2 PPARs 的激活与生理作用
• 1.3 PPARs 与糖尿病的关系
• 1.4 PPARs 抗糖尿病药物的研究现状
• 1.5 基于 PPARs 抗糖尿病药物的筛选和评价手段
• 1.6 PPARs 天然激动剂的研究进展
• 1.6.1 PPARγ的天然激动剂
• 1.6.2 PPARα的天然激动剂
• 1.6.3 PPARβ/δ的天然激动剂
• 1.6.4 PPARs 的多重天然激动剂
• 1.7 PPARs 拮抗剂
• 1.8 本课题的研究目的、意义与研究内容
• 1.8.1 研究目的
• 1.8.2 研究意义
• 1.8.3 研究内容
• 2 PPARs 高通量筛选模型的构建
• 2.1 PPARs 质粒的构建
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 实验结果
• 2.1.4 讨论
• 2.2 模型筛选条件的优化及评估
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 实验结果
• 2.2.4 讨论
• 2.3 本章小结
• 3 具有治疗糖尿病作用的天然药物提取物的制备
• 3.1 天然药物的选择
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.3 实验结果
• 3.1.4 讨论
• 3.2 提取流程及处理方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.3 实验结果
• 3.2.4 讨论
• 3.3 本章小结
• 4 PPARs 活性部位的筛选
• 4.1 PPARγ与 PPARβ活性成分的筛选
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.3 实验结果
• 4.1.4 讨论
• 4.1.5 结论
• 4.2 PPARα的活性成分筛选
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.3 实验结果
• 4.2.4 讨论
• 4.2.5 结论
• 5 二级组分及单体化合物对 PPARs 的激活作用
• 5.1 绿萝花的二级组分及单体化合物对 PPARs 的激活作用
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.3 实验结果
• 5.1.4 讨论
• 5.1.5 结论
• 5.2 川黄连中的小檗碱对 PPARs 的激活作用
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 实验结果
• 5.2.4 讨论
• 5.2.5 小结
• 6 PPARs 活性成分细胞毒性的研究
• 6.1 MTT 实验
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 实验方法
• 6.1.3 实验结果
• 6.2 讨论
• 6.3 结论
• 7 结论与展望
• 7.1 结论
• 7.2 展望
• 8 本文创新点
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• A 作者在攻读学位期间发表及拟发表论文目录
• B 作者在攻读学位期间参与的专利目录
• C 作者在攻读学位期间参与的科研项目目录