论文摘要
目的:建立香烟烟雾致体外人支气管上皮细胞恶性改变的细胞模型,研究香烟烟雾染毒诱发人支气管上皮细胞（BEAS-2B）恶性转化中相关基因表达情况和RASSF1A、MGMT、p16、APC、DAPK-1等基因启动子甲基化状况,探索吸烟致肺癌发生机制,为吸烟致肺癌防治提供理论依据。方法:将处于对数生长期的BEAS-2B细胞以1×105接种于Transwell培养皿中,细胞贴壁后将Transwell培养皿置于细胞气体染毒装置中染毒,培养基雾化泵入维持细胞生存环境,氧气浓度恒定于21%,水浴维持染毒腔温度在37℃。CCK-8法检测染烟后细胞增殖抑制率确定染烟浓度及时间,获得合适染毒浓度和染毒时间后进行正式染毒。染烟两次后将Transwell培养皿中细胞消化下置于培养瓶中常规培养,待生长至对数生长期后进行下一代染烟,共染烟40代。对照组暴露于烟雾浓度为0%的相同装置中,其余条件同染烟组。比较对照组细胞、染烟5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代细胞的一般生物学状况（生长状况、细胞形态学、细胞周期和细胞凋亡率）,血清抗性实验、锚着独立性生长实验等细胞恶性转化指标。对照组和各染毒组细胞再各传至20代时RT-PCR后检测各组p16、Survivin和bcl-2基因mRNA的表达水平。以甲基化特异性PCR（MSP）方法检测处于恶性转化各阶段中RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因启动子特异位点的甲基化状况;同时检测RASSF1A、MGMT基因mRNA表达情况。结果:（1）细胞染烟模型的建立。在染烟时间相同条件下,随染烟浓度升高,细胞增殖抑制率逐渐增加;在烟雾浓度相同条件下,随染毒时间延长,细胞增殖抑制率逐渐增加,最后确定染毒浓度和时间为20%,10min。随染烟代数的增加,人支气管上皮细胞BEAS-2B可发生恶性转化,表现为形态学和生长特性变化,细胞呈现异形性,核质比例增大,核仁大而多;细胞间失去接触抑制,呈复层重叠生长,细胞传代周期由4d缩短为2d;至染烟40代细胞融合率可达100%,而对照组细胞融合率达到80%后即出现生长停滞情况。随染烟代数的增加,细胞形态学及生长趋于稳定,表现出类似癌细胞的生长特性。各染烟组细胞G1期百分比明显减少,增殖指数明显升高,表明细胞处于增殖旺盛状态,其周期发生一定程度的失控,同时细胞凋亡率明显降低,呈现凋亡抑制状态。（2）对细胞恶性程度的变化分析发现:香烟烟雾染毒至5代时细胞即已获得恶性转化,表现为抗血清生长能力增强,在含10%血清培养基中细胞克隆形成率可达32.34%（P<0.05）,同时获得锚着独立生长能力,其克隆形成率可达8.48%（P<0.05）。至染毒40代细胞时上述两项指标分别达到97.11%、89.17%（均P<0.05）,表明该细胞恶性程度已相当高。bcl-2基因mRNA在对照组及各染毒组细胞均未表达; p16基因mRNA在对照组细胞中高表达,各染烟组细胞表达量围绕对照组表达量上下波动,总体呈现稳定表达趋势; Survivin基因mRNA在对照组细胞中无表达,随着染毒代数的增加均高表达,呈现剂量效应关系。（3）对RASSF1A、MGMT、p16、DAPK-1、APC基因启动子特异位点的甲基化状况进行检测后发现:对照组细胞RASSF1A、MGMT基因无甲基化表达,自染烟5代细胞开始即已开始甲基化表达,至染烟40代细胞一直稳定表达;对照组细胞及各染毒代细胞p16、APC基因均无甲基化表达;DAPK-1基因在对照组细胞及各染毒代细胞均为甲基化表达。对RASSF1A基因mRNA表达水平分析后发现:该基因在对照组细胞中高表达,各染烟组细胞mRNA表达水平均显著降低,并呈现剂量依赖性关系（P<0.01）。MGMT基因在对照组细胞高表达,染烟后表达水平均显著降低,同样呈现剂量效应关系（P<0.01）。结论:1.建立了香烟烟雾诱导BEAS-2B细胞体外恶性转化的细胞模型,获得了体外染毒的最佳浓度和最佳染毒时间。2.细胞恶性转化过程中相关基因表达发生了改变。3. RASSF1A、MGMT基因启动子区甲基化和表达水平降低可能在香烟烟雾诱导BEAS-2B细胞恶性转化中发挥重要作用。
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