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人骨钙素的基因克隆及其载体构建

2020-12-09阅读(369)

人骨钙素的基因克隆及其载体构建

论文摘要

Osteocalcin（骨钙素）是成骨细胞能够特异表达的少数几个蛋白之一,它具有激素的几个特征。例如,它作为前体分子合成,是细胞的特异分子,分泌后进入循环系统。在骨组织中骨钙素的含量比较丰富,它是由成熟的成骨细胞合成和分泌的,其中大部分沉积于骨基质中,大约五分之一释放入血,血清骨钙素含量与骨组织中骨钙素含量呈正相关性,因此血清骨钙素含量可以间接反映骨组织中骨钙素的合成状况。由于骨钙素主要在矿化形成期出现,所以它还被认为是成骨细胞向矿化发生期分化的标记之一。本文运用基因工程技术对骨钙素基因进行克隆,并将其转入真核和原核表达载体,实验通过改造pcDNA3.1（+）-HA、pcDNA3.1（+）-HA-His和pGEX-4T-1质粒,使得骨钙素基因在表达载体中与特异性标签HA、His以及GST蛋白溶合系统相结合,得到以下成果:①构建成功真核表达载体pcDNA3.1（+）-HA-BGP;②成功构建具有HA和His双标签的真核表达载体pcDNA3.1（+）-HA-His-BGP;③具有GST溶合表达系统的原核表达载体pGEX-4T-1-BGP成功构建,为后续的蛋白表达实验和功能实验提供实验平台和基础材料。最新研究发现骨钙素还具有调节糖代谢的功能,在调节糖代谢方面,它在牵制脂肪的同时还能提升胰岛素水平和胰岛素的吸收,骨钙素这种新的功能可能对糖尿病的治疗产生重要影响。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  • 1.1 骨钙素分子的研究现状
  • 1.2 骨钙素的分子结构及基因表达
  • 1.2.1 骨钙素的分子结构
  • 1.2.2 OC 基因的转录调控及机制
  • 1.3 骨钙素的表达
  • 1.3.1 骨钙素在骨骼中的表达
  • 1.3.2 骨钙素在软骨中的表达
  • 1.3.3 血液中的骨钙素
  • 1.3.4 骨钙素在其它组织的表达
  • 1.4 骨钙素的调节功能
  • 1.4.1 Osteocalcin 对血糖稳态的调控
  • 1.4.2 OST-PTP 对Osteocalcin 生物活性功能的调节
  • 1.4.3 Osteocalcin 在野生型小鼠中对糖代谢的调节功能
  • 1.5 影响BGP 的因素
  • 1.5.1 磷,钙及其比例
  • 1.5.2 维生素A
  • 1.5.3 维生素K
  • 1.5.4 维生素D
  • 1.5.5 激素对BGP 基因表达的调节作用
  • 1.6 骨钙素有待深入研究的问题
  • 第二章 骨钙素基因克隆及真核载体构建
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 实验材料
  • 2.1.2 实验试剂
  • 2.1.3 实验用具及仪器
  • 2.2 实验方法
  • 2.2.1 PCR 扩增骨钙素目的片段
  • 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 扩增产物（骨钙素）
  • 2.2.3 构建pcDNA3.1-HA 骨钙素表达载体
  • 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
  • 2.2.5 质粒的小量提取﹑纯化与检测
  • 2.3 结果
  • 2.3.1 质粒载体进行酶切
  • 2.3.2 外源基因BGP 和质粒载体的回收
  • 2.3.3 重组载体的构建
  • 2.3.4 重组克隆的筛选
  • 2.3.5 重组克隆的鉴定
  • 2.3.6 重组克隆序列的测定
  • 2.4 讨论
  • 第三章 PCDNA3.1（+）-HA-HIS-BGP 真核表达载体构建
  • 3.1 材料
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 PCR 扩增BGP 目的片段
  • 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 扩增产物（BGP）
  • 3.2.3 构建pcDNA3.1（+）-HA-His-BGP 表达载体
  • 3.2.4 pcDNA3.1（+）-HA-His-BGP 表达载体的转化及提取
  • 3.2.5 pcDNA3.1（+）-HA-His-BGP 表达载体的检测
  • 3.3 结果
  • 3.3.1 PCR 扩增BGP 目的片段
  • 3.3.2 PCR 扩增BGP 目的片段双酶切回收
  • 3.3.3 质粒载体的琼脂糖检测
  • 3.3.4 质粒载体双酶切的琼脂糖凝胶电泳检测
  • 3.3.5 酶连及重组克隆的筛选
  • 3.3.6 重组克隆的鉴定
  • 3.3.7 重组克隆序列的测定
  • 3.4 讨论
  • 第四章 原核表达载体PGEX-4T-1-BGP 的构建
  • 4.1 材料
  • 4.2 实验方法
  • 4.2.1 PCR 扩增骨钙素目的片段
  • 4.2.2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR 扩增产物（骨钙素）
  • 4.2.3 构建pGEX-4T-1 骨钙素表达载体
  • 4.2.4 感受态细胞转化
  • 4.2.5 质粒的小量提取﹑纯化与检测
  • 4.3 结果
  • 4.3.1 pGEX-4T-1 质粒提取与BGP 目的基因PCR 扩增
  • 4.3.2 目的基因PCR 扩增后纯化回收
  • 4.3.3 新提取质粒载体和目的基因BGP 双酶切
  • 4.3.4 外源基因和质粒载体胶回收
  • 4.3.5 重组载体的构建
  • 4.3.6 重组克隆的筛选
  • 4.3.7 重组克隆的鉴定
  • 4.3.8 重组克隆序列的测定
  • 4.4 讨论
  • 结论
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢

    • 相关论文文献

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