抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究

论文题目: 抗寒基因的克隆及根癌农杆菌介导的ICE1基因转化柑橘的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 果树学

作者: 黄家权

导师: 孙中海

关键词: 上胚轴,成年态茎段,抗寒,农杆菌介导的转化,基因

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 柑橘是世界上最重要的果树之一,在我国水果产业中占据了重要的经济地位。然而,周期性的冻害严重影响了柑橘的产量和品质,这个问题的解决有赖于柑橘的抗寒育种和抗寒栽培。柑橘类植物的多胚性、遗传背景复杂、童期长、单性结实的特点限制了柑橘常规育种的发展。柑橘组织培养以及建立在此基础上的遗传转化为缩短育种周期、获得抗寒、优质柑橘种质资源提供了新的途径。本实验以冷敏感的尤力克柠檬（Citrus limon（L.）Burm.f.cv.Eureka）上胚轴为材料,建立了高效的再生体系;以田间茎段为材料,建立了我国大力推广的栽培品种—纽荷尔脐橙（C.sinensis（L.）Osbeck cv.Newhall）的成年态组织培养体系,为成年态柑橘的遗传转化打下了基础。利用从拟南芥中克隆的ICE1基因构建了植物表达载体,并通过根癌农杆菌介导的方法将该基因导入了尤力克柠檬中,初步建立了根癌农杆菌介导的柠檬实生苗转化体系。主要研究结果如下: 1)研究了影响柠檬（C.limon（L.）Burm.f.cv.Eureka）不定芽再生的主要因素。结果表明:外植体类型,培养基中生长调节剂浓度配比,暗培养时间对柠檬不定芽的再生有显著的影响。上胚轴是再生不定芽的最佳外植体类型。上胚轴在基本培养基中能形成不定芽,BAP和NAA的加入则有利于不定芽的再生。当BAP和NAA浓度分别为1.0和0.1 mg L-1时,上胚轴不定芽分化率达到76.6%,此时不定芽数也达到最高,为9.25个。暗培养20 d有利于不定芽数的提高,最高达到每个上胚轴13.46个。不定梢在附加IBA或NAA的MT培养基中均可生成不定根。IBA有利于不定根的伸长,NAA有利于不定根数量的增加。 2)利用纽荷尔脐橙（C.sinensis（L.）Osbeck cv.Newhall）田间成年态茎段为材料,建立了高效的植株再生体系。实验结果表明:纽荷尔脐橙节段以及节间茎段均可通过器官发生途径再生不定芽。光照条件和植物生长调节剂的组合影响了不定芽的再生,在1.0 mg L-1 BAP和0.5 mg L-1 NAA的培养基中,15 d暗培养有利于不定芽的再生,此时节间茎段不定芽的再生率达到了85.2%,平均每个外植体上产生了3.7个不定芽。伸长的不定芽在附加0.5或1.0 mg L-1NAA的1/2MT生根培养基中生根并移栽成活。 3)根据GeneBank中已验证功能的甘油酸酰基转移酶（GPAT）基因序列以及类GPAT基因的Expression sequence tag（EST）设计一对兼并引物,扩增出了一条长约500 bp的片段,生物信息学分析表明该片段和已知的GPAT基因序列以及类GPAT基因没有明显的相似性,说明扩增的序列非目的片段。在文中对出现这种情

论文目录:

中文摘要

Abstract

第一章综述

第一节柑橘转基因研究进展

1 植物转基因历史和现状

2 转基因方法

2．1 DNA直接导入法

2．1．1 化学诱导的DNA直接转化法

2．1．2 物理诱导的DNA直接转化法

2．2 载体介导的DNA导入法

2．2．1 根癌农杆菌的生物学特性

2．2．2 根癌农杆菌 Ti质粒的结构和功能

2．2．3 根癌农杆菌介导的T- DNA在植物中的转化

2．2．4 农杆菌 T- DNA质粒载体系统

2．2．5 影响农杆菌转化效率的因素

2．2．5．1 农杆菌菌株的选择

2．2．5．2 诱导条件的选择

2．2．5．3 外植体的选择和预处理

2．2．5．4 抗生素的选择

3 柑橘遗传转化发展现状及存在的问题

3．1 柑橘遗传转化发展现状

3．2 柑橘遗传转化存在的问题

3．2．1 转化中使用的外植体类型

3．2．2 抗性芽的生根

3．2．3 转化使用的目的基因

第二节植物抗寒基因工程

1 抗冻蛋白

2 小分子渗透调节剂

3 脂肪酸去饱和酶

4 抗氧化酶

5 抗寒锻炼相关基因

6 柑橘抗寒育种研究进展和局限性

第三节课题的提出

1 柑橘抗寒基因工程育种研究的必要性

2 本研究的目的意义

第二章尤力克柠檬组织培养体系的建立

1 前言

2 材料和方法

2．1 不同外植体不定芽再生的诱导

2．2 上胚轴不定芽诱导条件的优化

2．3 不定芽生根

2．4 培养条件

3 结果

3．1 不同外植体的不定芽再生率

3．2 植物生长调节剂对不定芽再生的影响

3．3 暗培养对柠檬上胚轴切段不定芽再生的影响

3．4 不定芽生根

4 讨论

第三章纽荷尔脐橙成年茎段器官直接发生途径再生不定芽

1 前言

2 材料和方法

2．1 材料

2．2 培养条件

2．3 实验设置和数据处理

3 结果

3．1 外植体、光照以及 BAP和 NAA对不定芽再生影响

3．2 不定芽生根

4 讨论

第四章植物抗寒基因的克隆以及植物表达载体的构建

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株、质粒以及实验药品

2．2 方法

2．2．1 积壳叶片总 DNA的提取

2．2．2 设计兼并引物扩增枳壳 GPAT基因片段

2．2．3 扩增GPAT基因片段的条件

2．2．4 总RNA的提取

2．2．5 cDNA的合成

2．2．6 PCR扩增ICE1编码区

2．2．7 扩增产物的克隆以及序列分析

2．2．8 质粒提取

2．2．9 ICE1基因表达载体的构建

2．2．10 pMVICE1转化农杆菌

3 结果

3．1 枳壳 GPAT基因的引物设计

3．2 枳壳 GPAT基因片段的扩增和序列分析

3．3 拟南芥 RNA的提取与 RT-PCR扩增ICE1基因片段

3．4 ICE1基因片段序列测定和分析

3．5 ICE1基因的酶切及表达载体的构建

4 讨论

第五章根癌农杆菌介导的柠檬上胚轴转化 ICE1基因研究

1 前言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 供试植物材料

2．1．2 农杆菌和质粒

2．1．3 主要生化试剂

2．2 培养条件及不同的培养基配方

2．3 实验方法

2．3．1 柠檬上胚轴对卡那霉素、头孢霉素敏感性

2．3．2 菌液的准备

2．3．3 柠檬上胚轴遗传转化过程

2．3．4 遗传转化条件的选择

2．3．5 抗性芽的生根与移栽

2．3．6 PCR鉴定

2．3．7 转化效率的数据统计

2．3．8 Southern杂交验证

3 结果

3．1 抗生素对柠檬上胚轴不定芽再生的影响

3．2 影响柠檬上胚轴转化效率的因素分析

3．2．1 外植体苗龄

3．2．2 外植体预培养时间

3．2．3 外植体在农杆菌中的侵染时间

3．2．4 乙酰丁香酮浓度

3．2．5 共培养时间

3．2．6 共培养温度

3．2．7 共培养培养基

3．3 柠檬上胚轴的转化及植株再生

3．4 转化植株的分子检测

4 讨论

第六章问题和展望

1 柑橘理想的转化系统

2 柑橘转基因育种

3 柑橘转化中使用外植体

4 转化中目的基因的讨论

5 柑橘抗寒基因工程

6 转基因安全性的讨论

参考文献

附录Ⅰ 常用分子生物学操作

附录Ⅱ 博士在读期间发表的文章

致谢

发布时间: 2005-12-05

参考文献

[1].调控内源生长激素提高柑橘再生及遗传转化效率的研究[D]. 胡威.湖南农业大学2017
[2].柑橘体细胞胚发生的细胞学及生理生化特性研究[D]. 刘华英.湖南农业大学2003
[3].湖南柑橘资源的遗传多样性及营养光合特性研究[D]. 李润唐.中南林业科技大学2006
[4].广西柑橘溃疡病病原分析与流行学研究[D]. 任建国.广西大学2006
[5].柑橘三倍体种质资源的创造及遗传分析[D]. 宋健坤.华中农业大学2006
[6].柑橘速衰病毒的遗传多样性研究[D]. 张建坤.华中农业大学2006
[7].柑橘衰退病毒的进化与起源初步分析[D]. 易龙.西南大学2007
[8].钙信号系统调节柑橘抗寒生理生化机理的研究[D]. 李新国.华中农业大学2006
[9].柑橘衰退病毒的血清学特性分析及其诱导寄主差异表达基因的筛选[D]. 王彩霞.华中农业大学2007
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