论文摘要
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease AD）是一种慢性、进行性、神经退行性疾病，以颅内β-淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）沉积、神经纤维缠结和老年斑形成为主要病理特征，表现为大脑皮层和海马胆碱能神经元进行性退变、认知功能下降。目前对AD的形成和发病机制的认识主要集中于遗传和环境因素所引起的脑内慢性炎症和胆碱能系统功能进行性下降，但具体环节还不清楚，因此，对AD的治疗存在极大困难。AD的发生、发展与中枢炎症有关。炎症是Aβ沉积引起的继发性反应，也是导致神经元退行性变的重要因素。参与炎性反应的细胞主要有星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞。这些细胞激活后可释放多种细胞因子、趋化因子、补体及其激活物，导致非特异性炎细胞浸润，产生慢性炎症，使神经系统受损。Aβ形成后既可对神经细胞产生直接毒性作用，又可通过激活神经系统中胶质细胞和少突胶质细胞释放炎性介质，触发神经细胞损伤的信号通路，导致神经元损伤。增加颅内胆碱能水平和N型乙酰胆碱受体激动剂对AD有一定疗效，但作用机理尚不清楚。有证据显示外周迷走神经受刺激后释放的胆碱能神经递质与巨噬细胞(α7-nAChR受体作用，可以抑制巨噬细胞炎性介质的合成与分泌，削弱外周炎性反应。在中枢神经系统虽然没有外周巨噬细胞，但有大量的星形胶质细胞和与外周巨噬细胞相似功能的小胶质细胞参与Aβ介导的中枢炎性反应，那么，星形胶质细胞是否也具有α7-nAChR以及激活星形胶质细胞α7-nAChR能否削弱Aβ介导的中枢炎性反应便值得关注。据此，本研究采用细胞培养，通过细胞生物学和分子生物学技术，首先明确α7-nAChR在大鼠海马和星形胶质细胞的表达，然后观察Aβ介导的海马星形胶质细胞炎性介质的表达与分泌，并通过α7-nAChR激动剂，探讨海马星型胶质细胞α7-nAChR激活在Aβ引起的炎性反应中的作用。方法：1．海马脑片培养取出生10 d的SD大鼠海马进行切片，将经过漂洗后海马脑片置于膜插件上进行液气交界培养。前3天培养条件为5％CO2、37℃，每天换液1次，而后每3天换液1次，温度降至33℃。2．海马星形胶质细胞培养取新生SD大鼠，消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，分离海马，经胰蛋白酶消化后离心，弃上清再制成细胞悬液，接种至细胞培养瓶中培养。待混合培养细胞生长至8-10天，收集贴壁细胞进行继续培养，并通过星形胶质细胞特异性抗体检测GFAP的表达，以鉴定星形胶质细胞的纯度。3．α7-nAChR在体内、体外海马星形胶质细胞上的表达从大鼠脑中分离海马后进行冰冻切片，采用免疫荧光双染技术，首先用-GFAP抗体对星形胶质细胞进行鉴定，再观察α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达。体外表达的研究在培养的海马脑片和星形胶质细胞上进行，分别采用免疫组化，免疫细胞化学，荧光双染技术，用配体结合实验和细胞免疫荧光双标，分析α7-nAChR在星形胶质细胞上的表达。4．星形胶质细胞α7-nAChR激活对炎性介质分泌的影响分离并培养星形胶质细胞，并分别收集激活与未激活α7-nAChR的星形胶质细胞培养上清液，采用液相芯片技术，检测上清中白细胞介素-1、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、巨噬细胞炎性蛋白-1、RANTES的变化，明确胶质细胞α7-nAChR在削弱Aβ所致炎性反应中的作用。结果：1．海马脑片培养：培养海马脑片，最初结构较模糊，随着培养时间延长，脑片明显变薄，结构逐渐清楚。10 d后海马结构更为明显，此时用MTT染色法鉴定培养海马脑片活力，发现几乎所有海马脑区均显兰紫色，说明海马脑片培养成活。2．星形胶质细胞培养与鉴定：原代培养细胞主要是以星形胶质细胞为主，并含有小胶质细胞、神经元细胞和少量的少突胶质细胞。传代培养后，神经元消失。通过振摇获得纯化的星形胶质细胞，在显微镜下呈单层生长，互不重叠，细胞形态不规则，胞体粗大，胞突较丰富，多分支，以特异性抗-GFAP抗体为探针进行荧光细胞免疫鉴定，呈阳性。3．α7-nAChR在星形胶质细胞的表达：海马组织中抗-GFAP染色阳性的细胞抗-α7-nAChR染色也呈阳性，但仅部分抗-α7-nAChR染色阳性的细胞抗-GFAP染色也呈阳性。体外单细胞培养的星形胶质细胞既能与FITC标记的α-BTX结合，荧光染色呈阳性，同时，细胞免疫荧光双标分析显示星形胶质细胞抗-GFAP和抗-α7-nAChR染色均呈阳性。4．Aβ与星形胶质细胞炎性因子的分泌：在培养的胶质细胞中加入200nmol／LAβ后，IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和MIP-1、RANTES含量变化各不相同，其中Aβ对IL-1α的表达无明显影响；对IL-1β的影响表现在Aβ作用48 h之后，当作用至72 h和96 h时，IL-1β分别增加至原来的2.1倍和6.3倍；IL-6与IL-1β变化相似，作用至72 h和96 h时，分别增加至原来的2.1倍和8倍；TNF-α在Aβ作用48 h前变化均较小，作用96 h增加至原来的4.7倍；而趋化因子MIP-1变化最为明显，从Aβ作用8 h就开始升高，随着作用时间延长，呈时间依赖性增加，当作用96 h时，可增加至原来的12倍；虽然RANTES也是趋化因子，其变化量不如MIP-1，Aβ作用96 h仅能使其增加4.8倍。5．α7-nAChR激活对Aβ介导星形胶质细胞炎性因子分泌的影响：用烟碱预激活胶质细胞α7-nAChR可以明显削弱Aβ介导的胶质细胞炎性介质（除IL-1α外）的分泌，其中IL-1β、IL-6、TNF-α和MIP-1、RANTES分别由原来的6.3、8、4.7、12、4倍降至2.1、3.0、1.6、4.8、1.5倍，同α7-nAChR激活前比较，差别有统计学意义。结论：1．α7-nAChR在体内体外的星形胶质细胞上均能正常表达。2．星形胶质细胞α7-nAChR的激活既可削弱Aβ引起的星形胶质细胞炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的释放，也能削弱Aβ引起的星形胶质细胞趋化因子分泌增加。