两株产甾体皂甙华重楼内生细菌的筛选与发酵条件的研究

论文摘要

从华重楼（Paris polyphylla var Chinensis）的新鲜块茎中分离得到107株内生菌。对这107株菌进行了液体培养,经TLC初步检测鉴定,有多株菌产生甾体皂甙或其类似物。本文对其中2株菌进行了研究,编号分别为RZ03和RZ07。根据薄层检测结果,菌株次生代谢物与重楼总皂甙有显色相同、迁移率相当的层析带,初步表明其可能产生重楼甾体皂甙,并进一步证明其中水解后含有薯蓣皂甙元,需进一步研究菌株产生何种甾体皂甙及其是否具有重楼药用活性。根据其形态及生长特征和生理生化特征,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（第九版）,初步鉴定RZ03是肠杆菌科（Enterobacteriaceae）细菌,RZ07是芽孢杆菌属（Bacillus）细菌。经TLC筛选检测,菌株RZ03和RZ07可产生薯蓣皂甙。进行了形态和生理生化鉴定并将菌株的16S rDNA序列分别为用Blastn调出GenBank+EMBL+DDBJ中同源序列,ClustalW绘制系统发育树,RZ03与DQ019167（Exiguobacterium acetylicum）同源性为99 % ,鉴定为Exiguobacterium acetylicum RZ03;RZ07与调出的DQ207730（Bacillus subtilis）序列同源性为99%,初步鉴定为Bacillus subtilisRZ07。对RZ03的发酵产物进行了初步的抗菌活性及发酵条件研究,结果表明:（1）最适发酵培养基组成为:15%土豆汁,3%麸皮汁,2.5%蔗糖,0.15% MgSO4·7H2O,0.3%KH2PO4。（2）最适发酵条件为:发酵周期6-7天,温度35℃,发酵培养基的起始pH5.0-6.0 ,发酵培养基装量100-120ml/500m1三角瓶,摇床转速120-160r/min,最适接种量10%-5% （v/v）。（3）热稳定性测定表明:所含活性物质不耐热,但有少量耐热成分。

论文目录

• 摘要
• 英文摘要
• 1 综述
• 1.1 重楼属植物的主要化学成分
• 1.1.1 甾体类
• 1.1.2 植物甾醇及氨基酸
• 1.1.3 植物蜕皮激素及黄酮
• 1.2 植物内生菌研究概况
• 1.2.1 植物内生菌的分布及种类
• 1.2.1.1 内生菌的分布特点
• 1.2.1.2 内生菌的种类
• 1.2.2 植物内生菌的侵染途径
• 1.2.3 植物内生菌的生物学作用
• 1.2.3.1 内生菌的固氮作用
• 1.2.3.2 内生菌的促进植物生长作用
• 1.2.3.3 内生菌增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等作用
• 1.2.4 植物内生菌的代谢物质
• 1.2.4.1 产生抗菌类物质
• 1.2.4.2 产生抗癌类物质
• 1.2.4.3 产生杀虫物质
• 1.2.4.4 酶类代谢物质
• 1.2.5 从植物内生菌中寻找有用次生代谢产物的理论基础
• 2 产薯蓣皂甙华重楼内生菌的筛选与鉴定
• 2.1 实验材料、仪器设备
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养基的制备
• 2.2.1.1 分离培养基
• 2.2.1.2 发酵培养基
• 2.2.1.3 细菌鉴定用培养基
• 2.2.2 重楼内生菌的分离
• 2.2.3 发酵液中甾体皂甙的初步检测
• 2.2.3.1 重楼总皂甙的制备
• 2.2.3.2 菌株发酵液中甾体皂甙的TLC 检测
• 2.2.3.3 样品制备
• 2.2.3.4 标准液的制备
• 2.2.3.5 薯蓣皂甙及其甙元的TLC 鉴定
• 2.2.3.6 菌株发酵液的显色反应
• 2.2.4 菌株的鉴定
• 2.2.4.1 菌株的形态特征
• 2.2.4.2 菌株生理生化特征鉴定
• 2.2.4.3 菌株16S rDNA 序列分析
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 重楼内生菌的分离
• 2.3.2 发酵液中甾体皂甙的初步检测
• 2.3.2.1 发酵液中甾体皂甙的TLC 检测
• 2.3.2.2 发酵液的初步鉴定
• 2.3.2.3 薯蓣皂甙元的TLC 鉴定结果
• 2.3.2.4 发酵液的显色反应
• 2.3.3 菌株形态及生理生化鉴定
• 2.3.3.1 菌株形态及生理生化特征
• 2.3.4 菌株16S rDNA 序列分析
• 2.3.4.1 菌株染色体DNA 和PCR 扩增产物
• 2.3.4.2 PCR 产物测序
• 2.3.4.3 以16S rDNA 为基础的系统发育分析
• 3 对细菌摇瓶培养中培养基的筛选及培养条件的优化
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.1.1 菌种
• 3.1.1.2 培养基
• 3.1.1.3 试验中选用的碳源和氮源
• 3.1.1.4 主要仪器
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 不同碳源对细菌发酵液抗菌活性的影响
• 3.1.2.2 不同氮源对细菌发酵液抗菌活性的影响
• 3.1.2.3 培养基的优化
• 3.1.2.4 细菌最适发酵条件的优化
• 3.2 结果
• 3.2.1 不同碳源对RZ07 发酵液抗菌活性的影响
• 3.2.2 不同氮源对RZ07 发酵液抗菌活性的影响
• 3.2.3 培养基的优化
• 3.2.4 最适发酵条件的优化
• 3.2.4.1 细菌最适发酵周期的测定
• 3.2.4.2 RZ07 最适发醉温度的测定
• 3.2.4.3 发酵液最适起始pH 值
• 3.2.4.4 最适装量的测定
• 3.2.4.5 摇床最适转速的测定
• 3.2.4.6 最适接种量的测定
• 3.2.4.7 热稳定性的测定
• 3.3 讨论
• 4 讨论
• 4.1 从植物中寻找新的微生物资源
• 4.2 关于植物内生菌分离方法
• 4.3 关于甾体皂甙的薄层层析（TLC）检测
• 4.4 关于内生菌的种属鉴定
• 4.5 关于内生菌的生物活性与用途
• 参考文献
• 在校期间科研成果
• 致谢