A型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的原核表达及间接ELISA方法的建立

论文摘要

禽流感严重威胁着世界的养禽业及人类的健康。许多国家采用多种疫苗来控制和消灭禽流感。随着疫苗的广泛使用,无法区分野毒感染和疫苗免疫的禽群,干扰了禽流感的检疫及其流行病学调查,掩盖了禽流感的流行,增加了禽流感的预防难度。研究表明,禽流感的非结构蛋白NSl在感染早期,就大量存在于病毒感染的细胞中,但在病毒粒子中却检测不到NS1蛋白。即NS1蛋白在病毒复制的早期就大量表达,仅出现于病毒感染的细胞内,而且能诱导机体产生针对NS1蛋白的抗体。这提示我们,NS1蛋白可作为一种鉴别诊断标志,通过检测抗NS1蛋白的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫的禽群,以此作为早期感染的依据。并且NS1蛋白作为A型流感病毒的非结构蛋白,具有高度的保守性,在临床应用中作为鉴别诊断免疫禽和自然感染禽的检测抗原具有广阔前景。本试验根据GeneBank公开发表的禽流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）序列设计引物,用PCR方法扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白NS1的基因,并将该片段定向插入到原核表达载体pET-32a（+）中,获得了重组表达质粒pET-NS1。将其转化宿主菌BL21（DE3）,经IPTG诱导,融合表达了NS1蛋白的基因。经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmo1/L,诱导时间为5h。Western-blot分析表明:重组蛋白能与H9N2亚型AIV野毒感染阳性血清发生特异性反应,分离表达产物经His·bind柱子纯化后获得纯度较高的NS1蛋白。以此作为诊断抗原包被酶标板,建立了检测AIV抗体的间接ELISA方法。最佳包被浓度为1.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1:40,酶标二抗的最佳工作稀释度为1:2000。特异性试验表明:重组NS1蛋白除不与灭活疫苗免疫的禽血清反应外,也不与NDV,IBV,IBDV,EDSV感染的血清发生反应,具有良好的特异性。NS1蛋白能特异地区分野毒感染和灭活疫苗免疫禽群,可作为一种鉴别诊断标记。NS1-ELISA方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断、适时监控和净化提供了行之有效的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 禽流感病毒概述
• 1.2 禽流感的症状和病理变化
• 1.3 禽流感流行状况
• 1.4 禽流感疫苗的研究进展
• 1.5 禽流感非结构蛋白的研究
• 1.6 本试验的目的与意义
• 2 试验材料、流程与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 实验流程
• 2.3 试验方法
• 3 试验结果与分析
• 3.0 NS1 蛋白基因的扩增与克隆
• 3.1 重组表达载体双酶切鉴定
• 3.2 目的基因表达和SDS-PAGE分析
• 3.3 表达产物的可溶性分析
• 3.4 表达产物的 Western -blot 检测与分析
• 3.5 最佳诱导条件的确定
• 3.6 ELISA 方阵滴定结果与分析
• 3.7 NS1-ELISA敏感性试验结果与分析
• 3.8 NS1-ELISA 特异性试验结果与分析
• 3.9 临床样品的检测结果
• 4 结果讨论
• 4.1 关于pET32a（+）原核表达系统
• 4.2 关于NS1 蛋白的基因表达区域的选择
• 4.3 AIV H9N2 株NS1基因的亚克隆
• 4.4 关于NS1 重组蛋白的纯化
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介