人肝癌细胞中DHRS4LI选择性剪切新亚型的鉴定和分析

论文摘要

全反式维甲酸（all-trans Retinoic Acid,atRA）是体内类激素样生理活性物质,在哺乳动物包括人类,成体内atRA浓度过高或过低都可能会导致各种疾病和肿瘤的发生。在体内,atRA是由维生素A（vitamin A ）也称视黄醇（Retinol）经两步代谢生成,其中间代谢产物为视黄醛（Retinal）。成体内Retinal的生理作用剂量范围也很窄,过高或过低均可会对机体产生不利影响。因此,体内atRA和Retinal的代谢均受到严格精细的调控作用,整个代谢过程是一个由多酶参与的调节过程。近年来本课题组一直致力于一种全称为辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶（NADP（H）- dependent retinol dehydrogenase/ reductase,NRDR）的短链脱氢酶（short-chain dehydrogenase /reductase,SDR）的研究。NRDR最早从兔肝细胞质溶胶中纯化得到,是atRA代谢中的限速酶,具有很高的视黄醇氧化、视黄醛还原活性,且广泛分布于哺乳动物组织中。较之于短链脱氢酶家族中已知的其它成员,NRDR在生理条件下表现出更强的视黄醛还原活性,因此,它在维持体内RA及Retinal的代谢平衡中发挥重要的调节作用。Genebank中登陆号为AB045133的cDNA被认为是NRDR的编码基因,称为DHRS4。人DHRS4基因簇有三个基因拷贝,分别为DHRS4,DHRS4L2与DHRS4L1（又称为DHRS4X）,其中前二者相似性很高（90%-98%;≥1kb）属于片段复制（Segmental Duplication）。DHRS4L1与DHRS4和DHRS4L2之间的同源性分别为77.8%和77.7%。在研究基因表达与调控的过程中,我们发现DHRS4基因簇的3个拷贝基因存在非常复杂的转录及选择性剪接方式,从而产生多种选择性剪接亚型,这些剪接亚型在不同组织中表达情况的差异具有重要的临床意义。本研究从人肝癌细胞HepG2中鉴定出DHRS4L1选择性剪接新亚型,检测其在不同组织和细胞中的表达情况,并探讨其临床意义。我们首先采用RACE（cDNA末端快速扩增法）方法成功地从HepG2细胞中获得选择性剪接新亚型的3’末端cDNA序列,鉴定其结构推测其5’末端cDNA序列,进而得到其cDNA序列,全长1117bp;运用生物信息学方法对新亚型序列进行分析比对发现,该新亚型的cDNA序列与DHRS4LI基因高度同源,命名为DHRS4L1A1;通过人基因组Blast分析,该新亚型DHRS4L1A1由于选择性剪接造成了第37外显子丢失,并保留第2外显子和第3外显子之间一段长度为85bp内含子序列,结构为E1-E2-insertion-E8-E9-E10;通过查找开放阅读框架,发现该剪接新亚型的可阅读框架在1699bp之间,预测其编码的蛋白质序列为232个氨基酸,具有SDR家族2个保守的模序TAXXXGXG与YXXSK及过氧化物酶体定位信号SRL。用RT-PCR方法对该剪接新亚型在8种常见的细胞株中的表达情况进行半定量分析,结果显示该新亚型在肿瘤细胞中的表达明显高于正常细胞,尤其在卵巢癌细胞SKOV3中的表达量显著高于其他肿瘤细胞,提示DHRS4L1A1可能参与生殖系统相关酶类的代谢。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词简表
• 第一章 前言
• 1.1 研究基础
• 1.1.1 NRDR与atRA的代谢调节
• 1.1.2 DHRS4 基因簇结构及其转录调节
• 1.1.3 选择性剪接
• 1.1.4 半定量RT-PCR
• 1.2 研究意义
• 1.3 研究目标和研究内容
• 1.3.1 研究目标
• 1.3.2 研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞株来源
• 2.1.2 细菌和载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 细胞总 RNA 提取
• 2.2.3 3’RACE 法
• 2.2.4 胶回收试剂盒回收 PCR 产物
• 2.2.5 感受态细胞的制备
• 2.2.6 PCR 产物的体外连接
• 2.2.7 重组质粒的转化
• 2.2.8 菌落 PCR 筛选阳性克隆并测序
• 2.2.9 新亚型序列分析
• 2.2.10 RT-PCR 半定量分析
• 第三章 结果和讨论
• 3.1 细胞总RNA提取结果
• 3.1.1 两种方法提取细胞总RNA
• 3.1.2 小结
• 3.2 新亚型DHRS4L1A1 的鉴定
• 3.2.1 HepG2 细胞mRNA 的RT-PCR
• 3.2.2 胶回收试剂盒回收目的条带
• 3.2.3 重组质粒菌落PCR并测序
• 3.2.4 小结
• 3.3 新亚型全长cDNA的克隆
• 3.3.1 3’末端的克隆
• 3.3.2 新亚型全长cDNA的验证
• 3.3.3 小结
• 3.4 序列分析
• 3.4.1 分析DHRS4L1A1 结构
• 3.4.2 预测DHRS4L1A1 的ORF和氨基酸序列
• 3.4.3 预测由DHRS4L1A1 编码的蛋白质的空间构型
• 3.4.4 小结
• 3.5 不同细胞株表达情况的半定量分析
• 3.5.1 RT-PCR引物设计结果
• 3.5.2 不同细胞株中DHRS4L1A1 表达结果
• 3.5.3 小结
• 3.6 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 硕士期间发表论文情况
• 个人简介