芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及病毒基因组变异研究

论文题目: 芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及病毒基因组变异研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 植物病理学

作者: 施曼玲

导师: 周雪平

关键词: 芜菁花叶病毒,雪菜,基因,基因,单克隆抗体,三抗体夹心,抗性

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 1.芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及检测研究 1.1 浙江雪菜花叶病病原鉴定 从浙江宁波雪菜上获得病毒分离物NBXC,摩擦接种8种鉴别寄主。病毒提纯后,经电镜观察,可发现大量长约740nm的线形粒子。利用IC-RT-PCR对病毒分离物NBXC的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,分别得到约0.85kb和1.4kb的两条条带,与预期的芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）的CP和HC-Pro基因大小吻合。扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度为1374个核苷酸,编码458个氨基酸。NBXC的CP和HC-Pro基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为90.0～98.3%和82.2～96.9%,氨基酸同源率分别为95.8～99.3%和95.6～99.3%。间接酶联免疫吸附法（Indirect ELISA）检测,TuMV的检出率为83.6%,所有的样本都没有检测到黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic ivirus,CMV）和烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）。根据以上试验结果判断:浙江雪菜花叶病的主要病原是TuMV。 1.2 芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及检测研究 芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠后,取脾细胞与SP2/O鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（MAb）的杂交瘤细胞,并制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34KD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1:5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出七种作物上有TuMV侵染。 1.3 利用芜菁花叶病毒单克隆抗体测定雪菜品种对TuMV的抗病性 对57个雪菜栽培品种进行温室和大田人工接种,以鉴定其对TuMV抗性。温室和大田接种实验鉴定出抗TuMV的雪菜品种有7个,耐病品种22个,感病品种28

论文目录:

致谢

摘要

Abstract

第一章 芜菁花叶病毒研究进展

1.芜菁花叶病毒普通生物学研究

1.1 分布

1.2 寄主与病症

1.3 传播

1.4 病毒亚结构

1.5 株系(或致病型)

1.6 寄主植物的抗性

1.7 TuMV侵染对寄主生理生化特性的影响

1.8 病害流行和防治

2.芜菁花叶病毒分子生物学研究

2.1 TuMV基因组的结构

2.2 TuMV基因组的功能

2.2.1 P1蛋白

2.2.2 HC-Pro蛋白

2.2.3 P3蛋白

2.2.4 6K1蛋白

2.2.5 CI蛋白

2.2.6 6K2蛋白

2.2.7 VPg蛋白

2.2.8 NIa蛋白

2.2.9 NIb蛋白

2.2.10 CP蛋白

2.3 TuMV基因组的变异

2.4 寄主的抗性基因

2.5 转基因研究

3.芜菁花叶病毒病原的检测与鉴定

3.1 利用寄主病症和寄主范围

3.2 利用病毒传播方式、病毒包含体和电镜

3.3 利用ELISA

3.4 利用单克隆抗体

3.5 利用分子生物学技术

第二章 芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及检测研究

第一节 浙江雪菜花叶病病原鉴定

1.材料与方法

1.1 常用生化试剂

1.2 常用缓冲液的配制

1.3 毒源与抗血清

1.4 病毒提纯

1.5 病毒粒子的电镜观察

1.6 提纯病毒紫外检测

1.7 鉴别寄主反应

1.8 IC-RT-PCR(Immunocapture RT-PCR)

1.8.1 cDNA合成

1.8.2 PCR扩增

1.8.3 PCR产物纯化

1.9 目的片段连接

1.10 感受态细胞制备方法(TB法)转化

1.11 转化

1.12 菌落PCR

1.13 重组质粒的提取纯化

1.14 酶切鉴定

1.15 TuMV CP和HC-Pro基因的序列测定与分析

1.16 间接酶联免疫吸附法(Indirect ELISA)检测

2.结果与分析

2.1 提纯病毒的电镜观察

2.2 鉴别寄主的反应

2.3 IC-RT-PCR扩增及扩增产物的克隆和序列测定

2.4 间接酶联免疫吸附测定结果

3.讨论

第二节 芜菁花叶病毒单克隆抗体制备及检测应用

1.材料与方法

1.1 毒源及抗血清

1.2 常用生化试剂

1.3 常用缓冲液的配制

1.4 单克隆抗体的制备

1.4.1 免疫小鼠

1.4.2 细胞融合

1.4.3 杂交瘤细胞筛选与克隆

1.4.4 腹水单抗的制备

1.4.5 腹水单抗的效价测定

1.4.6 腹水单抗的纯化

1.5 单抗亚类鉴定

1.6 Western印迹分析

1.6.1 植物可溶性蛋白样品的制备

1.6.2 SDS-PAGE

1.6.3 电转移

1.6.4 Western印迹分析

1.7 TAS-ELISA方法的建立

1.7.1 TAS-ELISA操作步骤

1.7.2 TAS-ELISA最适条件测定

1.8 TAS-ELISA灵敏度测定

1.9 TAS-ELISA的特异性检测

1.10 TAS-ELISA检测田间病样

2.结果与分析

2.1 杂交瘤细胞的融合、筛选与克隆

2.2 腹水抗体纯化、效价测定及抗体类型

2.3 Western blot分析

2.4 TAS-ELISA最适条件确定

2.4.1 多抗血清最适工作浓度

2.4.2 单抗腹水最适工作浓度

2.5 TAS-ELISA灵敏度测定

2.5.1 病叶粗汁液

2.5.2 提纯病毒

2.6 TAS-ELISA的特异性检测

3.讨论

第三节 利用芜菁花叶病毒单克隆抗体测定雪菜品种对TuMV的抗病性

1.材料与方法

1.1 毒源与抗血清

1.2 供试品种

1.3 温室接种实验

1.4 大田接种实验

1.5 病情调查

1.6 TAS-ELISA检测

2.结果及分析

2.1 病情调查

2.2 TAS-ELISA检测

3.讨论

第三章 TuMV分离物的CP和HC-Pro基因变异及进化

1.材料与方法

1.1 病毒分离物

1.2 RT-PCR扩增CP和HC-Pro基因

1.2.1 RNA抽提

1.2.2 cDNA合成

1.2.3 PCR扩增

1.3 PCR产物纯化

1.4 PCR产物克隆与筛选

1.5 CP和HC-Pro基因的序列测定与分析

2.结果及分析

2.1 CP和HC-Pro基因的RT-PCR扩增

2.2 CP和HC-Pro基因的序列测定

2.3 TuMV的CP基因序列同源性分析

2.3.1 TuMV中国分离物的CP基因序列同源性比较

2.3.2 TuMV国内外分离物的CP基因序列比较

2.4 TuMV国内外分离物的HC-Pro基因序列比较

3.讨论

参考文献

附录A 常用生化及分子生物学试剂与仪器

附录B 常用缓冲液及培养基配方

发布时间: 2005-07-22

参考文献

• [1].芜菁花叶病毒CI蛋白参与病毒复制和运动及其与寄主的相互作用研究[D]. 邓萍.福建农林大学2015
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