虾蟹螺原体病免疫组化和病理学比较研究

论文摘要

中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasma eriocheiris）,是近年来在水生甲壳动物中发现的新型病原微生物,该病原体可引起中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）颤抖病（Tremor disease）,还可以导致南美白对虾（Penaeus vannamei）、克氏原螯虾（Procambarus clarkia）、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的大规模死亡,给我国虾蟹等重要的经济水生甲壳动物的养殖造成了极大威胁。螺原体是原核细胞生物中最小的一类,可滤过220nm孔径滤膜,它有一种特殊的顶端结构,能使其粘附在宿主细胞表面,这与螺原体的侵染和致病有关。该病原体在宿主细胞内存在侵染方式有：1、单个分散形式；2、众多螺原体在细胞内大量繁殖后聚集形成包涵体,其大小不等,形态不一,由于螺原体体积很小,在光镜下不宜辨认,所以普通的H.E染色很难确定螺原体感染的病理学特征。本文运用免疫组化方法开展了螺原体对河蟹和克氏原螯虾不同器官和组织的感染病理学研究。在河蟹和克氏原螯虾的各个组织包括心肌、肝胰腺、肠、鳃,以及感染发病严重个体的肌肉组织均呈现阳性反应,大量的螺原体寄生于结缔组织中,聚集形成包涵体,呈棕黄色颗粒状,单个散在形式存在的螺原体呈淡黄色。通过螺原体不同菌株对罗氏沼虾进行感染实验,经过二十多天的观察统计,发现1～3组中无论是实验组还是对照组,在接种后的前几天基本都出现个别虾死亡的现象,最可能的原因是接种时机械损伤和应激反应导致个体死亡。用分离自中华绒螯蟹的螺原体菌株BY08-1接种罗氏沼虾其死亡率高于对照组,但死亡率不是很高（33%）。而用分离自罗氏沼虾的螺原体菌株MR10感染健康罗氏沼虾,随着感染时间的延长,发病率和死亡率随之明显上升,至最后,死亡率达到95%。虽然两种菌株均分离自水生甲壳动物,属于水生螺原体,但由于最初分离的寄主不同,其对罗氏沼虾的致病性存在明显差别。随后进行免疫组化实验,分别用中华绒螯蟹螺原体多抗和罗氏沼虾螺原体多抗与患螺原体病的罗氏沼虾组织进行反应,结果显示罗氏沼虾螺原体多抗反应强烈,而中华绒螯蟹螺原体多抗阳性反应较弱,也进一步证实了从不同水生动物上分离到的螺原体对不同寄主存在感染差异。基于以上的研究结果,即从不同水生动物上分离到的螺原体存在感染差异,本文对不同来源的螺原体感染宿主的超微病理学进行了比较研究。结果显示螺原体在患颤抖病河蟹的各个组织中主要以包涵体的形式寄生在细胞质内；在患螺原体病罗氏沼虾的各个组织中更多的是以散状的方式寄生。不同寄主来源的水生螺原体菌株对于不同的宿主具有不同侵染能力和毒力,推测可能是水生螺原体在不同寄主之间存在变异和寄主选择压力造成的。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 虾蟹螺原体病研究进展
• 1.2 螺原体类微生物生物学特性及致病性研究进展
• 1.2.1 螺原体类微生物生物学特性
• 1.2.2 螺原体类微生物致病性研究进展
• 1.3 中华绒螯蟹"颤抖病"病理学研究现状
• 1.4 免疫组化技术研究进展及其在病原微生物检测中的应用
• 1.4.1 免疫组化技术的分类
• 1.4.2 免疫组化技术在病原微生物检测中的应用
• 1.4.3 免疫组化技术在水产研究中的应用
• 第2章 河蟹与克氏原螯虾螺原体病免疫组化初步研究
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 回感实验
• 2.2.2 多克隆抗体的制备
• 2.2.3 组织病理切片
• 2.2.4 HE染色
• 2.2.5 免疫组化（IHC）反应
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 回感实验
• 2.3.2 HE染色
• 2.3.3 免疫组化
• 2.3.4 电镜（TEM）观察
• 2.4 讨论
• 第3章 罗氏沼虾螺原体病免疫组化及不同来源的螺原体对该虾感染致病性比较研究
• 3.1 实验材料和方法
• 3.1.1 不同寄主来源螺原体菌株的分离和培养
• 3.1.2 罗氏沼虾的饲养
• 3.1.3 不同寄主来源螺原体对罗氏沼虾的感染实验
• 3.1.4 罗氏沼虾螺原体多克隆抗体的制备（同第一章2.2.2）
• 3.1.5 组织病理切片和免疫组化（IHC）反应比较实验（同第一章2.2.3,2.2.5）
• 3.2 结果
• 3.2.1 不同寄主来源螺原体对罗氏沼虾的感染实验
• 3.2.2 免疫组化结果比较分析
• 3.3 讨论
• 第4章 河蟹与罗氏沼虾螺原体病的病理学比较研究
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 样品采集和组织处理
• 4.2.2 电镜（TEM）技术
• 4.3 结果
• 4.3.1 患"颤抖病"河蟹组织超薄切片的电镜观察结果
• 4.3.2 患"螺原体病"罗氏沼虾组织超薄切片的电镜观察结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录:读研期间科研成果
• 致谢