RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响

论文摘要

第一部分RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响目的我们以前的研究发现，雌二醇可下调人成骨样MG63细胞CTGF的表达，但人成骨样MG63细胞CTGF表达下调所引起的生物学效应尚不清楚。本研究用RNA干扰技术，阻断CTGF在人成骨样MG63细胞中的表达，观察CTGF降表达后对人成骨样MG63细胞Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响。并观察抑制CTGF的内源性的表达对人成骨样MG63细胞活力的影响。方法针对人CTGF mRNA 440、875、910位点设计、合成三对21核苷酸siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）；在阳离子脂质体介导下转染人成骨样MG63细胞，以空白及非特异性siRNA作为对照，转染48h后收集细胞。采用Northern杂交观察CTGF mRNA表达水平的改变，半定量RT-PCR观察Ⅰ型胶原、ALP、MMP-1、MMP-2 mRNA表达的改变，western blotting观察CTGF、MMP-1、MMP-2蛋白表达的变化。MTT法测定RNA干扰后人成骨样MG63细胞活力。结果体外转录合成的siRNA1（对应于440位点）、siRNA3（对应于910位点）转染人成骨样MG63细胞后，能抑制CTGF mRNA和蛋白的表达，其中siRNA1的抑制作用更为显著，可将CTGF蛋白抑制达70％以上，siRNA2（对应于875位点）对人成骨样MG63细胞CTGF的表达无明显作用；在siRNA1、siRNA3组，随CTGF表达下调，成骨细胞的Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达明显下调，而在siRNi2组Ⅰ型胶原、ALP mRNA表达则无明显变化；在siRNA1、siRNA3组，随CTGF表达下调，MMP-1mRNA和蛋白表达明显下调，而MMP-2 mRNA、蛋白表达均无明显变化。此外，我们还观察到，CTGF表达下调使siRNA1组和siRNA3组的人成骨样MG63细胞存活率显著降低。结论CTGF表达下调可抑制MG63细胞Ⅰ型胶原、ALP、MMP-1mRNA的表达，下调MMP-1蛋白的表达，降低MG63细胞活力，但对MMP-2 mRNA及蛋白表达无明显变化。说明CTGF是维持人成骨样MG63细胞存活、正常分化所必需的细胞因子；CTGF可能通过调节基质金属蛋白酶的表达在维持骨代谢平衡中发挥重要的作用。第二部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响目的研究重组人结缔组织生长因子（recombinant human connective tissue growth factor rCTGF）对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响。方法用rCTGF干预体外培养的人成骨细胞，采用3H-TdR掺入法检测人成骨细胞增殖率，α-磷酸萘酚法测定细胞内碱性磷酸酶活性变化，放免法测定骨钙素含量的变化，western blotting检测Ⅰ型胶原表达的变化，应用流式细胞仪检测rCTGF对成骨细胞凋亡的影响；采用荧光染料吖啶橙和溴化乙锭染色，激光共聚焦显微镜观察rCTGF对细胞凋亡的影响。结果rCTGF呈剂量依赖性促进人成骨细胞增殖，200ng／mL rCTGF达最大促增殖效应；rCTGF干预显著促进人成骨细胞分化，rCTGF呈剂量依赖性增加Ⅰ型胶原、骨钙素表达及碱性磷酸酶活性；rCTGF干预可无血清诱导的成骨细胞凋亡减少48％，激光共聚焦显微镜观察结果显示200ng／mL rCTGF干预组凋亡细胞数明显减少。结论rCTGF可显著促进人成骨细胞的增殖和分化，并抑制人成骨细胞凋亡。CTGF通过增加成骨细胞的数量、增加骨基质的合成，具有刺激骨形成的作用。，因为rCTGF仅含成熟CTGF C-末端结构域，所以CTGF主要通过其C-末端结合区发挥促进人成骨细胞增殖、分化的生物学效应。第三部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞护骨素／核因子κB受体活化配体表达的影响目的研究重组人结缔组织生长因子（recombinant human connective tissue growth factor rCTGF）对体外培养的人成骨细胞护骨素／核因子κB受体活化配体表达的影响，探讨结缔组织生长因子调节护骨素／核因子κB受体活化配体表达的信号转导机制。方法用重组人结缔组织生长因子干预体外培养的人成骨细胞，采用western blotting检测护骨素／核因子κB受体活化配体蛋白表达水平的变化，同时观察重组结缔组织织生长因子对人成骨细胞焦点黏附酶（focal adhesion kinase FAK）、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase MAPK）及AKT磷酸化的影响。结果rCTGF可呈时间-剂量依赖性地抑制人成骨细胞RANKL的表达，200ng／ml CTGF作用24～48h达最大抑制效果，而对人成骨细胞OPG的表达无明显影响。rCTGF可明显增强p38-MAPK磷酸化，并减少FAK磷酸化，rCTGF干预对p42／44 MAPK、JNK及AKT磷酸化无明显影响；p38-MAPK阻断剂SB 23058可阻断rCTGF对RANKL表达的抑制效应。结论rCTGF通过增强p38-MAPK磷酸化，减少FAK磷酸化，下调人成骨细胞RANKL的表达。CTGF通过降低人成骨细胞RANKL的表达，可抑制破骨细胞的形成，从而有助于骨代谢平衡的维持。第四部分重组人结缔组织生长因子对人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的影响目的研究重组人结缔组织生长因子（recombinant human connective tissue growth factor rCTGF）对体外培养的人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的影响，并探讨结缔组织生长因子调节膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2表达的信号转导机制。方法用重组人结缔组织生长因子干预体外培养的人成骨细胞，采用western blotting检测膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2蛋白表达水平的变化，同时观察重组结缔组织织生长因子对人成骨细胞MAPK及AKT磷酸化的影响。结果rCTGF可呈时间—剂量依赖性地促进人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2的表达，200ng／mlCTGF作用24～48h达最大效果。rCTGF可明显增强p38-MAPK磷酸化，p38-MAPK阻断剂SB 23058可阻断rCTGF上调膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2的效应。结论rCTGF通过活化p38-MAPK，上调人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1及基质金属蛋白酶-2的表达。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、论文
• 前言
• 第一部分 RNA干扰沉默CTGF对人成骨样MG63细胞基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 重组结缔织生长因子对人成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 重组结缔织生长因子对人成骨细胞护骨素/核因子κB受体活化子配体表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 重组结缔织生长因子对人成骨细胞膜型基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-2表达表达的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 四、综述
• 参考文献
• 五、致谢
• 六、在读期间发表论文情况