论文摘要
基于酶对特定底物响应而构建的电化学酶生物传感器，具有灵敏度高、响应快、选择性好、无污染、易于微型化和自动化等优点，具有广泛的应用前景。在电化学酶生物传感器的研制中，一项关键的技术就是如何将酶稳定地固定到基体电极表面的生物敏感膜上并保持其生物活性不变。本论文工作致力于发展新型固定材料，以达到改进固定酶活性、降低传感器的成本等目的，结合流动注射分析技术，制备了金胶壳聚糖仿生膜，用于固定辣根过氧化物酶（HRP）检测H2O2，并在此基础上研制了肿瘤标志物癌胚抗原（CEA）免疫传感器，应用于临床上血清中CEA含量的测定。主要研究工作如下：1、利用壳聚糖强的成膜能力，首先在掺铟氧化锡（ITO）电极表面修饰上壳聚糖膜，然后通过膜表面丰富的氨基和羟基与纳米金强静电结合，在ITO电极表面获得掺杂纳米金胶粒子的壳聚糖仿生膜，用来固定HRP，这层膜可以有效的保持酶原有活性不变。结合流动注射分析，构建了一种可以快速测定H2O2的流动注射安培传感器。该传感器分别用扫描电镜、原子力显微镜和电化学方法进行了表征，结果表明，酶分子可以很好的固定在仿生膜上。在实验中，对下列实验条件进行了优化：底物邻苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）浓度、缓冲溶液的pH值和固定化酶的量进行了优化。在优化的实验条件下检测H2O2，在0.01 mM～0.5 mM浓度范围内呈线性，其线性相关系数为0.997（n=8），检测限为0.005 M。用流动注射分析验证了制备的传感器的稳定性，结果表明，在连续34次测定同一浓度H2O2后，该传感器的安培响应信号没有显示出明显的下降。由于工业上的大批量生产而使ITO薄膜电极价廉易得，这就大大降低了制备传感器的成本，所以该传感器具有成本低、制备简单、灵敏度高、稳定性好的优点，可适用于批量生产。2、将CEA抗原固定在纳米金胶壳聚糖仿生膜修饰的ITO电极上，研制了一种新型的测定临床肿瘤标志物CEA的免疫传感器。通过待测抗原和固定化抗原与有限的酶标抗体活性点发生竞争性结合来进行免疫分析。和待测抗原反应的一部分标记抗体留在溶液中，而和电极上固定化抗原结合的另一部分标记抗体则留在电极表面，通过OPD-H2O2-HRP电化学体系检测体系进行测定。随着样品中抗原浓度的增大，留在溶液中与其反应生成免疫复合物的标记抗体的量也越大，从而和固定于电极表面的抗原发生免疫反应的标记抗体的量则减少，所以测定的微分脉冲伏安（DPV）峰电流信号随着待测抗原浓度的增大而呈线性下降趋势。在该实验中，对下列影响免疫测定的参数如底物OPD的浓度、H2O2的浓度、缓冲溶液的pH值、酶标抗体的稀释倍数、培育温度和培育时间进行了优化选择。在优化的实验条件下，CEA的线性检测范围为2.0-20 ng／ml，线性相关系数为0.997，检测限为1.0 ng／ml。制备的CEA免疫传感器具有成本低、制备简单、灵敏度高、稳定性好的优点，可适用于批量生产，有望用于临床上血清中肿瘤标志物的测定。