内质网应激和凋亡在遗传性包涵体肌病病理机制中的作用

论文摘要

目的:遗传性包涵体肌病（hereditary inclusion body myopathy,HIBM）是一种常染色体隐性遗传的远端型肌病,由位于9p12-13的GNE基因发生突变引起;临床上病变主要累及下肢远端肌肉,疾病后期也可累及全身其他部位肌群,病情进展比较缓慢;主要病理特征为镶边空泡形成、肌核或肌浆内管状细丝包涵体及成群的肌纤维萎缩,很少发现肌纤维坏死和再生,这些显著的病理学形态特征提示其有独特的病理学意义,但其病原学和发病机制仍然未知。有研究证实在包涵体内有多种异常蛋白质的表达,包括Aβ（amyloid-β）、朊蛋白（prion）、泛素（ubiquiton）、tau蛋白等。2004年Vattemi发现散发性包涵体肌炎（sporadic inclusion body myositis,s-IBM）患者的肌肉中存在内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）和非折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）;由于HIBM和s-IBM病理改变非常相似,只是后者伴有明显的炎细胞浸润,因此我们推测ERS和UPR可能在HIBM病理机制中起重要作用。2001年Yan C通过免疫组化和TUNEL方法发现在HIBM患者中存在凋亡现象,而ERS又可以通过激活caspase-12诱导细胞凋亡,因此我们应用免疫组化、免疫印迹方法探索异常蛋白质、内质网应激与肌纤维凋亡过程之间的关系,从而探讨HIBM的病理机制。材料和方法:选取山东大学齐鲁医院神经肌肉病研究室接诊的7例临床和病理诊断为HIBM患者的肌肉标本,一部分制成8μm冰冻切片,采用常规组织化学染色观察HIBM患者的肌肉病理特点;一部分制成5μm冰冻切片,应用原位TUNEL染色方法观察HIBM患者肌纤维的凋亡现象,并采用荧光免疫组织化学染色（IHC,fluorescentimmunohistochemistry）检测2种内质网分子伴侣蛋白—BiP/GRP78和calnexin,以及2种凋亡蛋白—caspase-12和caspase-3在HIBM患者肌纤维中的表达情况,同时用双重免疫荧光染色（double immunofluorescence）分析内质网分子伴侣蛋白和凋亡蛋白与肌纤维内包涵物Aβ的关系;对染色显示蛋白表达增高病人的冰冻肌肉标本,采用免疫印迹技术（western blotting,WB）进行半定量分析。TUNEL染色和IHC染色时选取3例DMD、3例PM及3例病理报告为正常的肌肉标本作为对照;WB分析时选取3例病理报告为正常的肌肉标本作为对照。结果:1.常规组织化学染色发现HIBM主要病理改变为肌纤维大小不等,萎缩纤维散在或成群分布,可见镶边空泡,内核纤维增多,坏死和再生现象较轻微,肌间质增生,无炎细胞浸润。2.TUNEL染色发现仅在HIBM组肌纤维中有数量不等的TUNEL阳性肌核,多位于外形正常肌纤维的肌膜下,中央核偶见阳性,镶边空泡内未发现阳性肌核。3.①IHC染色可见,在所有HIBM肌活检中,70%～80%的空泡肌纤维含有大量边界清楚,大小不一,呈斑片状、点状或长条状的抗内质网分子伴侣抗体强阳性的包涵物,这些包涵物主要分布在肌纤维的非空泡肌浆部分,除此之外,在所有肌活检中,10%～15%的非空泡纤维或其他外形正常的肌纤维也含有相同的包涵物;②双重免疫荧光染色可见,在所有异常肌纤维中,表达内质网分子伴侣BiP/GRP78阳性的包涵物内同时可见Aβ表达,calnexin阳性肌纤维的连续切片上Aβ亦阳性。③WB分析发现BiP/GRP78（78-KD）在HIBM患者均有不同程度表达增加,而在正常肌肉中没有;calnexin（90-KD）在不同患者增高程度不一,但均较对照肌肉明显增加。4.①IHC证实凋亡通路信号蛋白caspase-12在部分肌纤维内表达增加;凋亡执行酶活性caspase-3未见表达增加,而部分肌纤维内可见caspase-3表达增加;②用双重免疫荧光染色可见,在所有异常肌纤维中,表达caspase-3阳性的包涵物内同时可见Aβ表达;caspase-12阳性肌纤维的连续切片上Aβ亦阳性;③WB分析显示,caspase-12表达为约50-KD的前体蛋白和30～40-KD的裂解片段,HIBM组表达量较对照肌肉明显增高;活性caspase-3的条带未见出现,但caspase-3前体蛋白（35-KD）表达量较对照肌肉增高。结论:1.HIBM患者中内质网分子伴侣蛋白BiP/GRP78和calnexin表达的增高,证实了在HIBM中存在ERS和UPR。2.原位TUNEL阳性表达、凋亡通路信号蛋白caspase-12及凋亡执行酶caspase-3的表达增高均显示HIBM患者肌纤维存在凋亡现象。3.Aβ与内质网分子伴侣蛋白、Aβ与凋亡蛋白同时表达提示异常折叠蛋白可能诱发ERS,后者通过激活caspase-12,从而激活caspase-3最终导致肌纤维发生部分凋亡,并形成镶边空泡,后者为HIBM的特征性病理改变。意义:1.本研究通过不同的方法发现和证实HIBM患者肌纤维存ERS和UPR。2.本研究通过不同的方法发现和证实HIBM患者肌纤维存在凋亡现象,后者可能是HIBM肌核改变,镶边空泡形成以及肌纤维萎缩的重要病理基础。3.研究还发现本病内质网应激是启动凋亡的关键途径,这些发现可以为本病的干预治疗研究提供重要的依据。

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