单克隆抗体检测炭疽芽孢

论文摘要

炭疽芽孢杆菌是一种杆状革兰氏阳性细菌,且能引起人畜共患的炭疽病。在营养匮乏时,炭疽芽孢杆菌可产生芽孢,以抵御环境中的不利因素。由于炭疽芽孢具有极强的生命力,一直被列入生物武器中头号战斗剂。因此,如何快速,准确的检测炭疽芽孢成为当今人类必须要解决的难题。本研究中,通过灭活的炭疽芽孢作为免疫原,筛到了三株高亲和力且特异性很好的单克隆抗体(8G3,10C6,12F6)。这三株抗体不仅可以识别炭疽芽孢表面,还可直接检测完整的炭疽芽孢杆菌,并且同苏云金、蜡样等芽孢杆菌属的其它成员无交叉反应。其中,单克隆抗体8G3与炭疽芽孢亲和力最高,而12F6则是用于炭疽芽孢杆菌检测的最佳选择。经鉴定,三株抗体的靶抗原均是EA1蛋白。EA1,作为炭疽芽孢杆菌S层的主要抗原之一,已经被广泛认知。然而,研究者们对“EA1是否也是真正的芽孢蛋白”这一问题有着不一样的看法。我们的试验结果表明,在纯化、洗涤芽孢的过程中,该蛋白持续且大量的存在于炭疽芽孢表面。即使经过严谨洗涤的炭疽芽孢,依然可以被我们的单克隆抗体识别。因此,不管上述问题的答案是肯定还是否定,EA1都可用作炭疽芽孢检测的靶标。除此之外,我们首次将表面等离子共振(SPR)传感器应用于炭疽芽孢的检测,并且建立了直接,快速,灵敏且无标记的炭疽芽孢检测方法。该方法基于BIAcore3000传感器,特异性单克隆抗体8G3及消减抑制试验,可在40 min之内,检测出浓度低至为10~4 CFU/ml的炭疽芽孢,并且很容易将其与苏云金,蜡样等其它近缘细菌的芽孢分开。因此,该方法可作为实验室检测炭疽芽孢的另一种选择,一旦便携式SPR可以获得,即可应用于炭疽芽孢的现场检测。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第1章 炭疽芽孢杆菌致病机制及检测研究进展
• 1.1 炭疽芽孢杆菌的形态极其分类
• 1.2 炭疽病
• 1.2.1 皮肤炭疽（cutaneous anthrax）
• 1.2.2 吸入炭疽（inhalatinal anthrax）
• 1.2.3 胃肠道炭疽（gastrointestinal anthrax）
• 1.3 炭疽芽孢杆菌的毒力因子以及致病机理
• 1.3.1 毒素质粒和荚膜质粒
• 1.3.2 保护性抗原（PA）
• 1.3.3 致死毒素
• 1.3.4 水肿毒素
• 1.4 检测方法
• 1.4.1 细菌学检测
• 1.4.2 核酸检测
• 1.4.3 免疫学检测
• 1.4.4 适配子检测
• 1.4.5 化学分析检测
• 1.4.6 生物传感器检测
• 1.4.7 生物芯片检测
• 1.5 结论
• 第2章 抗炭疽芽孢表面抗原单克隆抗体的制备
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 动物和细胞
• 2.2.2 菌株
• 2.2.3 试剂
• 2.2.4 仪器设备
• 2.2.5 溶液配制
• 2.2.5.1 细菌培养基
• 2.2.5.2 细胞培养相关溶液
• 2.2.5.3 ELISA相关溶液
• 2.2.5.4 单抗纯化相关溶液
• 2.2.5.5 SDS-PAGE电泳相关溶液
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 芽孢抗原的制备
• 2.3.1.1 芽孢培养与纯化
• 2.3.1.2 芽孢计数
• 2.3.1.3 芽孢灭活
• 2.3.2 小鼠免疫
• 2.3.3 ELISA检测方法的建立
• 2.3.4 骨髓瘤细胞的复苏与培养
• 2.3.5 饲养细胞的制备
• 2.3.6 细胞融合
• 2.3.6.1 收集骨髓瘤细胞
• 2.3.6.2 分离脾细胞
• 2.3.6.3 融合
• 2.3.7 阳性杂交瘤细胞筛选与克隆化
• 2.3.8 杂交瘤细胞的冻存与复苏
• 2.3.9 单克隆抗体的腹水生产及纯化
• 2.3.9.1 腹水生产
• 2.3.9.2 单克隆抗体纯化（正辛酸-饱和硫酸铵沉淀法）
• 2.3.10 单克隆抗体的鉴定
• 2.3.10.1 单克隆抗体分型（ELISA）
• 2.3.10.2 单克隆抗体效价的测定
• 2.3.10.3 单克隆抗体特异性鉴定
• 2.3.10.4 杂交瘤细胞稳定性鉴定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 扛原制备
• 2.4.2 ELISA检测方法的建立
• 2.4.3 ELISA检测免疫小鼠的血清效价
• 2.4.4 细胞的融合与筛选
• 2.4.5 单克隆抗体性质的鉴定
• 2.4.5.1 单克隆抗体亚类的鉴定
• 2.4.5.2 单克隆抗体的亲和力鉴定
• 2.4.5.3 单克隆抗体的特异性鉴定
• 2.4.5.3.1 单克隆抗体对炭疽芽孢的特异性
• 2.4.5.3.2 单克隆抗体对炭疽芽孢杆菌的特异性
• 2.5 讨论
• 2.6 结论
• 第3章 单克隆抗体靶抗原的鉴定及相关研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株与质粒
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 仪器设备
• 3.2.4 溶液配制
• 3.2.4.1 细菌培养基
• 3.2.4.2 纯化芽孢外壁相关溶液
• 3.2.4.3 SDS-PAGE和Western Blot相关溶液
• 3.2.4.4 质谱分析相关溶液
• 3.2.4.5 蛋白质纯化相关溶液
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 芽孢外壁的纯化
• 3.3.2 SDS-PAGE和Western Blot
• 3.3.3 质谱分析
• 3.3.4 基因克隆
• 3.3.4.1 基因扩增
• 3.3.4.2 载体构建
• 3.3.4.3 大肠杆菌的转化
• 3.3.4.3.1 感受态细胞的制备
• 3.3.4.3.2 大肠杆菌的转化
• 3.3.5 蛋白质的表达与纯化
• 3.3.6 间接ELISA试验
• 3.3.7 免疫荧光试验
• 3.3.8 原子力显微镜（AFM）
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 芽孢外壁的纯化
• 3.4.2 单克隆抗体靶蛋白的鉴定
• 3.4.3 eag基因的克隆表达与蛋白纯化
• 3.4.4 单克隆抗体与EA1亲和力鉴定
• 3.4.5 免疫荧光试验
• 3.4.6 SA26与8G3的比较
• 3.4.7 洗涤对炭疽芽孢表面的影响
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 第4章 表面等离子共振传感器检测炭疽芽孢
• 4.1 前言
• 4.2 材料
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器设备
• 4.2.4 溶液配制
• 4.2.4.1 细菌培养基
• 4.2.4.2 夹心ELISA试验相关溶液
• 4.2.4.3 SPR试验相关溶液
• 4.3 试验方法
• 4.3.1 芽孢制备
• 4.3.2 夹心ELISA
• 4.3.3 SPR试验
• 4.3.3.1 抗体固定
• 4.3.3.2 芯片再生
• 4.3.3.3 SPR检测炭疽芽孢
• 4.3.3.4 特异性鉴定
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 夹心ELISA检测炭疽芽孢
• 4.4.2 抗体固定与芯片再生
• 4.4.3 SPR传感器检测炭疽芽孢
• 4.4.4 特异性鉴定
• 4.5 讨论
• 4.6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录