豆梨离体再生体系建立与rol B基因转化研究

论文摘要

豆梨是南方梨树常用砧木之一,适应性强,抗病,与梨的嫁接亲和性强。本研究以豆梨为试验材料,研究了影响豆梨子叶、茎段、叶片再生的一些因素,并将通过农杆菌介导方法将rolB基因导入豆梨子叶内,为豆梨的组织培养和遗传转化提供依据。主要研究结果如下:1.摸索出了豆梨种子二次消毒法,筛选出了比较适宜豆梨子叶的培养基,以MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L的子叶不定芽再生率最高,培养条件中的暗培养时间及子叶的接种方式均影响子叶的不定芽产生:不定芽继代时在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基上的4代不定芽平均增殖系数最高达9.12,1cm以上的不定梢经MS+IBA3.0mg/L-1培养基诱导20天转入MS+蔗糖5.0g/L上正常生根,生根后大多可以移栽成活。2.豆梨叶片、叶柄和节间经诱导均能产生愈伤组织,叶片在NN69+TDZ2.5mg/L+0.1NAAmg/L的培养基上有最高不定芽再生率为50%,叶柄和节间在NN69+6-BA2.5mg/L+NAA0.2mg/L的培养基上最高不定芽再生率分别为25%和15%。3.通过对子叶预培养时间、共培时间、菌液浸染时间、选择压等遗传转化影响因素的研究,初步建立了豆梨遗传转化体系:子叶暗培养4天后,经OD600值为0.6的农杆菌浸染10分钟后,黑暗共培60小时,转入筛选培养基上暗培养至抗性愈伤组织产生,后转入光培养获得抗性不定芽,此芽继代3-4次后扩繁。4.实验获得了7株具有Km抗性的豆梨转化植株,经PCR检测有4株呈阳性,后续研究有待进行。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 文献综述
• 1.1 梨组织培养研究进展
• 1.1.1 不同培养基上的再生
• 1.1.2 不同基因型梨的再生
• 1.1.3 不同外植体的再生
• 1.1.4 其他与再生密切相关的因素
• 1.2 国内外梨矮化砧木的研究现状
• 1.3 rol基因矮化性状研究
• 1.4 梨遗传转化研究
• 2 研究目的和意义
• 第二章 豆梨子叶高效离体再生体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 培养基制备
• 1.2.2 外植体消毒
• 1.2.3 培养基及生长调节剂筛选
• 1.2.4 接种方式的确定
• 1.2.5 不同暗培养时间的确定
• 1.2.6 子叶不定芽的增殖
• 1.2.7 生根培养
• 1.2.8 试管苗移栽
• 2 结果与分析
• 2.1 不同消毒时间及方式对子叶的影响
• 2.2 子叶不定芽产生动态
• 2.3 培养基及生长调节剂对豆梨子叶再生的影响
• 2.3.1 细胞分裂素及培养基类别的筛选
• 2.3.2 6—BA浓度及生长素的选用
• 2.3.3 植物生长调节剂对豆梨子叶再生的影响
• 2.4 不同的暗培养时间对豆梨子叶再生的影响
• 2.5 接种方式对豆梨子叶不定芽产生的影响
• 2.6 子叶不定梢增殖的影响因素
• 2.7 豆梨不定梢生根
• 2.7.1 不定根发生动态
• 2.7.2 不同培养基及激素对生根的影响
• 2.8 豆梨试管苗移栽
• 3.讨论
• 3.1 豆梨子叶消毒方法
• 3.2 影响豆梨不定芽产生的因素
• 3.3 影响豆梨不定根产生的因素
• 4 结论与展望
• 第三章 豆梨叶片、叶柄、茎段的再生
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 豆梨愈伤组织的诱导
• 1.2.2 不定芽的诱导
• 2.结果与分析
• 2.1 豆梨无菌外植体的获得
• 2.2 豆梨愈伤组织产生影响因素
• 2.3 豆梨不定芽再生影响因素
• 3 讨论
• 4 结论与展望
• 第四章 豆梨遗传转化体系的建立及转化植株的检测
• 1.材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌种活化
• 1.2.2 不定芽Km选择压的确定
• 1.2.3 不定根Km选择压的确定
• 1.2.4 共培时间的确定
• 1.2.5 植物材料预培养时间的确定
• 1.2.6 农杆菌浸染时间确定
• 1.2.7 抗性植株的获得
• 1.2.8 转化植株的PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 Km选择压的确定
• 2.2 共培时间对豆梨子叶转化的影响
• 2.3 预培时间对豆梨转化的影响
• 2.4 农杆菌侵染时间对豆梨转化的影响
• 2.5 转基因植株的获得
• 2.6 PCR分析结果
• 3 讨论
• 3.1 预培养对豆梨遗传转化体系建立的影响
• 3.2 浸染对豆梨转化的影响
• 3.3 共培对豆梨转化的影响
• 3.4 转化植株的选择
• 4 结论与展望
• 参考文献
• 图版及说明
• 致谢
• 个人简历