槐糖脂产生菌的筛选及槐糖脂抑菌和抗肿瘤作用的研究

论文摘要

表面活性剂在工农业生产和人类日常生活中的应用越来越广泛，但是通过化学法合成的表面活性剂在合成和使用的过程中会对环境造成污染和破坏。而生物表面活性剂是微生物在一定条件下代谢产生的或者通过酶法合成的，与化学法合成的表面活性剂相比有相同特性又有很多优点，特别是无毒、微生物可降解这一优点是化学法合成的表面活性剂所不可比拟的，因此在石油、环境、食品、农业及医药等方面具有极其重要的应用价值。 微生物产生的生物表面活性剂种类很多，槐糖脂由于结构特殊、无毒、生物可降解，容易获得并且产量较高，是目前研究较多、也是最具有应用前途的一种。对于槐糖脂的研究，目前主要集中在两个方面：一是提高槐糖脂的产量；二是槐糖脂的应用，集中在石油、环境保护、洗涤剂、化妆品等方面。槐糖脂在医药方面的应用研究不多，特别是槐糖脂的抗肿瘤作用机理研究国内外尚无报道。因此，有必要筛选新型的槐糖脂产生菌，并对槐糖脂的药效作用及其作用机理进行探讨，这将为抗癌新药的发现和开发提供可能和指导。 主要研究内容和结果如下： 1．新型槐糖脂产生菌的筛选。以菜籽油为唯一底物，通过富集培养、平板划线等方法筛选到200多株菌；利用油膜破裂法和测定发酵液的表面张力得到5株产表面活性剂的菌株；最后通过色谱技术，包括TLC（thin layerchromatography）、IR（infrared）spectra、HPLC、NMR（nuclear magnetic resonance）及MS（mass spectroscopy），进一步确定了产槐糖脂的菌株为Y2A。该菌株能将发酵液的表面张力降为37.3mN／m，产生的产物是糖脂的混合物，含量较高的主要有三种成分，其保留时间分别为33.28，34.62和38.15min，命名为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ，化合物Ⅲ是内酯型双乙酰槐糖脂。 通过形态学观察、生理生化实验及BIOLOG菌种鉴定系统对Y2A菌株进行种属鉴定，确定Y2A菌株为拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A)。这是

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号缩写说明
• 第一章 前言
• 1.1 表面活性剂和生物表面活性剂概述
• 1.1.1 生物表面活性剂的主要特征
• 1.1.1.1 与化学法合成的表面活性剂相同的特性
• 1.1.1.2 微生物产生的生物表面活性剂的优点
• 1.1.2 微生物产生的表面活性剂种类及微生物来源
• 1.1.3 微生物产生的表面活性剂在工农业及医学上的应用
• 1.2 槐糖脂
• 1.2.1 槐糖脂的发现
• 1.2.2 产槐糖脂的微生物
• 1.2.3 槐糖脂的生理功能
• 1.2.4 槐糖脂的合成途径
• 1.2.5 槐糖脂的生产方法
• 1.2.5.1 微生物发酵法
• 1.2.5.2 酶催化法
• 1.2.6 槐糖脂的应用
• 1.2.6.1 在石油工业中的应用
• 1.2.6.2 在环境保护中的应用
• 1.2.6.3 在化妆品和洗涤剂中的应用
• 1.2.6.4 在医药中的应用
• 1.3 天然抗肿瘤药物的筛选
• 1.3.1 细胞凋亡与细胞坏死
• 1.3.2 诱导细胞凋亡的因素
• 1.3.3 细胞凋亡的机制
• 1.3.3.1 细胞凋亡的调控基因
• 1.3.3.2 细胞凋亡的主要信号传导通路
• 1.3.4 细胞凋亡与肿瘤的治疗
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 第二章 槐糖脂产生菌的筛选、结构解析及菌种鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 仪器和试剂
• 2.1.2 样品
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 菌株分离
• 2.1.5 菌株初筛
• 2.1.6 菌株复筛和发酵产物分离鉴定
• 2.1.7 菌株的鉴定
• 2.1.7.1 酵母菌鉴定常规方法的内容
• 2.1.7.2 BIOLOG技术
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 槐糖脂产生菌的筛选
• 2.2.1.1 排油活性和表面张力的测定
• 2.2.1.2 薄层层析分析
• 2.2.1.3 粗提样品的红外光谱分析
• 2.2.1.4 粗提样品的分离纯化与制备
• 2.2.1.5 化合物Ⅲ的核磁共振谱分析
• 2.2.1.6 化合物Ⅲ的质谱分析
• 2.2.2 菌株的鉴定
• 2A的形态和大小'>2.2.2.1 菌株Y_2A的形态和大小
• 2.2.2.2 BIOLOG技术鉴定结果
• 2.3 本章小结
• 第三章 拟威克酵母产槐糖脂的培养基组成及发酵条件的研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 仪器和试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.3.1 斜面及种子YEPD培养基
• 3.1.3.2 发酵基本培养基
• 3.1.4 培养方法
• 3.1.4.1 液体种子培养
• 3.1.4.2 摇瓶培养
• 3.1.5 检测方法
• 3.1.5.1 葡萄糖浓度的测定
• 3.1.5.2 槐糖脂含量的测定
• 3.1.5.3 菌体浓度的测定
• 3.1.5.4 pH值的测定
• 3.2 结果
• 3.2.1 产槐糖脂培养基的优化
• 3.2.1.1 葡萄糖初始浓度对槐糖脂产生的影响
• 3.2.1.2 不同碳源对槐糖脂产生的影响
• 3.2.1.3 不同氮源对槐糖脂产生的影响
• 3.2.1.4 酵母粉浓度对槐糖脂产生的影响
• 3.2.1.5 培养基组成正交实验
• 3.2.2 摇瓶发酵条件的优化
• 3.2.2.1 初始pH对槐糖脂产生的影响
• 3.2.2.2 接种量对槐糖脂产生的影响
• 3.2.2.3 发酵时间曲线
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小结
• 第四章 拟威克酵母发酵液的理化性质及其乳化活性
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 仪器和试剂
• 4.1.3 培养方法
• 4.1.4 表面张力测定
• 4.2 结果
• 4.2.1 发酵液临界胶束浓度的测定
• 4.2.2 不同因素对发酵液性能的影响
• 4.2.2.1 NaCl浓度对发酵液表面张力的影响
• 4.2.2.2 pH对发酵液表面张力的影响
• 4.2.2.3 温度对发酵液表面张力的影响
• 4.2.3 发酵液的乳化活性
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 第五章 槐糖脂药效学的初步研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 仪器和试剂
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 样品
• 5.1.4 抑菌试验菌株
• 5.1.5 抑菌圈直径的测定
• 5.1.6 抑菌率的测定
• 5.1.7 抗肿瘤活性研究所用器皿和仪器
• 5.1.8 细胞培养用培养基及试剂
• 5.1.9 培养基及培养用液的配制
• 5.1.10 抗肿瘤研究所用的肿瘤细胞株
• 5.1.11 细胞传代培养方法
• 5.1.12 样品的稀释
• 5.1.14 数据分析
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 槐糖脂的抑菌作用
• 5.2.1.1 抑菌圈直径及抑菌率的测定
• 5.2.1.2 温度对内酯型双乙酰槐糖脂抑菌作用的影响
• 5.2.2 槐糖脂的抗肿瘤作用
• 5.3 本章小结
• 第六章 槐糖脂诱导肝癌细胞H7402凋亡的研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 仪器和试剂
• 6.1.2 样品及样品的稀释
• 6.1.3 细胞株
• 6.1.4 细胞传代培养方法
• 6.1.5 细胞的爬片
• 6.1.6 阴性对照组和空白对照组的设立
• 6.1.7 MTT法分析细胞存活率
• 6.1.8 半数杀伤浓度IC50的计算
• 6.1.9 倒置相差显微镜观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.1.10 Giemsa染色观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.1.11 激光扫描共聚焦观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.1.12 透射电镜观察样品作用后细胞核的变化
• 6.1.13 TUNEL检测细胞的凋亡
• 6.1.14 流式细胞技术检测细胞凋亡率及周期分布
• 6.1.15 Caspase-3活性分析
• 6.1.16 细胞内游离钙离子浓度检测
• 6.1.17 数据分析
• 6.2 结果
• 6.2.1 MTT法分析细胞存活率
• 6.2.2 倒置相差显微镜观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.2.3 Giemsa染色观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.2.4 吖啶橙染色观察样品作用后细胞形态的变化
• 6.2.5 透射电镜观察药物作用后细胞核的变化
• 6.2.6 TUNEL检测细胞的凋亡
• 6.2.7 流式细胞技术检测细胞凋亡率及周期分布
• 6.2.8 Caspase-3活性分析
• 6.2.9 细胞内游离钙离子浓度检测
• 6.3 讨论
• 6.4 本章小结
• 全文总结与展望
• 参考文献
• 在读期间已发表和录用的论文
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表