黄芪鲨烯合酶基因的克隆

论文摘要

荚膜黄芪为豆科黄芪属植物,中药上的黄芪指的是豆科植物膜荚黄芪或蒙古黄芪的干燥根,是我国著名的常用滋补中药。据药典记载,黄芪具有补气升阳、固表止汗、脱毒生肌、利水脱肿等功效,主治气虚衰弱、消化力弱、自汗、盗汗、高血压、糖尿病、水肿及疮疡久不收口等症。黄芪中含有黄芪皂苷、多糖、黄酮、微量元素和氨基酸等多种有效成分,其中黄芪皂苷是黄芪中主要的主要有效成分之一,具有降压、抗炎、镇痛和调节代谢等作用。国内外对于黄芪的研究,近些年来主要集中在黄芪的化学成分的提取和鉴定,以及各种化学成分的药理作用方面,而黄芪药用成分的生物合成方面的研究还尚未见报道。其应用基础研究尚很薄弱,特别是其药用成分黄芪皂苷类化合物的生物合成途径的相关基因的研究。因此对黄芪鲨烯合酶的基因克隆对黄芪和鲨烯合酶基因研究有一定的价值。鲨烯合酶,又称为角鲨烯合酶,能够催化鲨烯的合成,不仅鲨烯自身的生物活性很强,被广泛应用在医疗保健品和化妆品等方面,其下游甾体类和皂甙类产物具有重要的生理功能,鲨烯合酶的活性影响类异戊二烯途径中的其他支路,也关系到其竞争的半萜类、二萜类等物质,因此对于鲨烯合酶的研究越来越深入。根据其他物种的鲨烯合酶蛋白中的高度保守序列,并参照其基因序列设计了一对保守的中间引物和多对两端引物,通过多次PCR检测引物和中间引物扩增的效果,最后确定合适的一对两端引物。最终从荚膜黄芪中克隆到了鲨烯合酶基因cDNA序列（GenBank登录号HQ829974）。根据DNAMEN软件推测出黄芪鲨烯合酶蛋白序列,通过与豆科植物其他物种的氨基酸序列比对发现黄芪鲨烯合酶推测的氨基酸序列与大豆鲨烯合酶（BAA22559.1）和百脉根鲨烯合酶（AB102688.1）序列相似性最高,达到了88%,且通过系统发生树可以看到黄芪与百脉根进化关系在比较的几个物种中最近。对黄芪幼苗根叶茎中鲨烯合酶基因mRNA进行半定量PCR,结果表明鲨烯合酶在黄芪根叶茎中表达量是依次降低的。为了以后能够更方便的进行分离纯化黄芪中的鲨烯合酶蛋白,本实验中针对鲨烯合酶基因疏水片段设计了引物,经PCR扩增后片段连接到表达载体pET-32a（+） Vectors中,把重组质粒转化到Rosetta表达菌株中,经过IPTG进行诱导,成功进行了蛋白表达。黄芪鲨烯合酶的克隆填补了黄芪中黄芪皂苷类化合物的生物合成途径的相关基因研究的空白,为以后通过基因转化提高黄芪皂苷含量亦或通过生物工程手段生产黄芪皂苷打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 研究现状
• 1.1.1 近年来黄芪的研究进展
• 1.1.2 近年来鲨烯合酶的研究情况
• 1.1.3 鲨烯合酶促进和抑制途径
• 1.2 研究目的及意义
• 第2章 黄芪鲨烯合酶基因cDNA序列的克隆
• 2.1 实验材料与方法
• 2.1.1 实验材料与器材
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 黄芪鲨烯合酶的基因序列及特征分析
• 2.2.2 鲨烯合酶基因半定量PCR
• 2.3 讨论
• 第3章 黄芪鲨烯合酶部分肽段的原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料与器材
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 鲨烯合酶基因表达重组质粒的构建
• 3.2.2 鲨烯合酶部分cDNA 片段的表达
• 3.3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢