论文摘要
隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是由隐孢子虫（Cryptosporidium）寄生于人或动物胃肠道和呼吸道上皮细胞内引起的一种全球性的人兽共患原虫病.当前,世界卫生组织（WHO）将人的隐孢子虫病列为爱滋病（AIDS）的怀疑指标之一,是世界上最常见的6种腹泻病之一。自从1907年Tyzzer发现隐孢子虫以来已有100多年的时间,但是,仍然没有发现能有效治疗隐孢子虫病的药物。而且迄今为止,上海地区奶牛隐孢子虫的感染情况和基因型仍不清楚。因此,本文在建立隐孢子虫分子诊断方法的基础上,对上海地区奶牛隐孢子虫进行了分子流行病学调查和基因型鉴定,并研究了中草药提取物对隐孢子虫感染的体内外抑制作用。1、套式PCR检测奶牛隐孢子虫方法的建立以18S rRNA基因设计两对引物,对奶牛隐孢子虫进行套式PCR（nestedPCR）检测,并对PCR产物进行克隆测序。结果显示所建立的nested PCR能特异扩增奶牛隐孢子虫,而对照如牛球虫、新孢子虫、弓型虫和大肠杆菌均为阴性,灵敏度可达到每克粪便5个卵囊,微小隐孢子虫（C.parvum）和安氏隐孢子虫（C.andersoni）扩增产物片段大小分别为514 bp和509 bp.建立的nested PCR方法敏感性高、特异性强,为隐孢子虫分子流行病学调查打下了坚实的基础。2、实时荧光定量PCR检测奶牛隐孢子虫方法的建立根据GenBank公布的隐孢子虫18S rRNA基因序列设计引物及探针,并以标准基因组DNA为模板,建立基于SYBR Green和基于TaqMan探针检测奶牛隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法,并对奶牛C.parvum和C.andersoni阳性样品进行检测。结果表明,建立的SYBR Green法对C.parvum和C.andersoni均能扩增出曲线,TaqMan探针法仅能扩增C.andersoni,两者均不能扩增鸡贝氏隐孢子虫、弓形虫、新孢子虫和大肠杆菌;Real-time PCR的检测阈值为5个拷贝的标准基因组DNA和每克牛粪中的5个卵囊。本研究建立了快速、特异、敏感的隐孢子虫Real-time PCR法,可用于奶牛隐孢子虫的快速定量检测。3、上海地区奶牛隐孢子虫的分子流行病学调查及基因分型应用nested PCR和Real-time PCR对上海地区5个奶牛场进行隐孢子虫流行病学调查,对nested PCR扩增的18S rRNA部分序列进行酶切鉴定测序,并进行序列同源性分析和系统发育进化树分析。结果显示,5个牛场的隐孢子虫阳性率为16.03%（nested PCR）和15.56%（SYBR Green Real-time PCR）,C.andersoni的阳性率为9.2%（TaqMan Real-time PCR）;从春季到冬季,隐孢子虫的感染率分别为14.61%,10.56%,16.89%和23.08%,冬季的感染率显著高于其他季节（χ2＞9.20,P＜0.05）;犊牛（17.28%）与育成牛的感染率（16.46%）之间差异不显著（χ2=0.04,P＞0.05）,和产奶牛（7.5%）之间差异显著（χ2=4.15,P＜0.05）;通过卵囊的形态学和序列分析表明:上海地区奶牛感染的隐孢子虫与C.andersoni和C.parvum更接近,其中,C.parvum与“mouse”基因型有99.8%的同源性。4、中药提取物对微小隐孢子虫感染的抑制作用应用牛肾细胞（MDBK）体外感染模型,研究了甘草酸（GA）、绿原酸（CA）、虎杖苷（PD）、黄芪多糖（APS）、氧化苦参碱（OM）与巴龙霉素（PRM）对C.parvum感染的体外抑制作用,并进一步研究了APS、OM与PRM对C.parvum感染的体内抑制作用.体外试验表明:APS有较好的预防效果,APS、PRM和OM治疗效果优于其它中药组;体内试验表明:预防试验中,APS与OM各浓度组C.parvum感染数量均显著或极显著低于感染对照组（p＜0.05或p＜0.01）;治疗试验中,PRM与OM各浓度组C.parvum感染数量均显著或极显著低于感染对照组（p＜0.05或p＜0.01）.说明APS、OM与PRM均能不同程度的抑制隐孢子虫（卵囊）对MDBK细胞和KM小鼠的感染性.