乳酸菌快速检测方法的建立

论文摘要

乳酸菌是一群通过发酵糖类,产生大量乳酸的细菌总称。作为最具代表性的益生菌,乳酸菌在食品发酵、饮品和饲料等领域有着悠久的应用历史。由于它们的代谢特性和工艺学特性,需要在乳酸菌发酵食品生产过程中对它们进行安全和质量控制,因此建立快速可靠的乳酸菌检测鉴定方法,对生产过程控制以及产品质量检验具有重要意义。本论文对5株发酵乳酸菌菌株（1株植物乳杆菌、1株干酪乳杆菌、1株德氏乳杆菌保加利亚亚种、1株乳酸乳球菌乳脂亚种、1株嗜热链球菌）,分别设计了不同的引物和探针,对TaqManTM实时荧光PCR检测技术的进行了研究,包括引物和探针的特异性、检测方法的灵敏度以及对乳酸菌饮料中乳酸菌的检测。同时,本文还对变性高效液相色谱（PCR-DHPLC）检测技术进行了研究,对PCR-DHPLC条件进行了摸索和优化,初步建立了PCR-DHPLC对乳酸菌的检测方法。实验结果表明实时荧光PCR的五组引物和探针均对其相应的乳酸菌进行了有效的扩增,对其他近源菌属和远源菌属均无扩增信号出现,最低检测下限可达到24cfu/mL。优化后PCR-DHPLC的条件为:DNA浓度为50ng;退火温度为55℃;柱温为61℃;梯度洗脱程序为A∶B（体积比）为54∶46 （0 min）→48∶52（0.5 min）→44∶56（1.8min）→43∶57（3.0min）→41∶59（4.3min）→39∶61（5.5min）;流速为0.9mL/min。本文所建立的两种快速鉴定检测技术,即运用实时荧光PCR定性检测和运用PCR-DHPLC检测5种乳酸菌的技术,各具特点,实用性强,均可以应用到实际的乳酸菌鉴定和检验工作中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 乳酸菌定义及分布
• 1.2 乳酸菌在《伯杰氏系统细菌学手册》中的分类
• 1.3 乳酸菌食品中的应用
• 1.3.1 乳酸菌在发酵乳制品中的应用
• 1.3.2 乳酸菌在肉制品中的应用
• 1.3.3 乳酸菌在果蔬发酵中的应用
• 1.3.4 乳酸菌在酿造工业的应用
• 1.3.5 乳酸菌在其他领域的应用
• 1.4 乳酸菌的传统检测方法
• 1.4.1 乳酸菌的形态学观察
• 1.4.2 乳酸菌的生化鉴定
• 1.4.3 测定代谢产物
• 1.5 乳酸菌的分子生物学检测方法
• 1.5.1 实时荧光PCR 技术
• 1.5.1.1 实时荧光 PCR 技术原理
• 1.5.1.2 实时荧光PCR 技术在微生物领域的应用
• 1.5.1.3 实时荧光PCR 技术其他领域的应用
• 1.5.2 变性高效液相色谱（DHPLC）
• 1.5.2.1 DHPLC 原理
• 1.5.2.2 DHPLC 在微生物领域的应用
• 1.5.2.3 DHPLC 在其他领域中的应用
• 1.5.3 其他分子生物学检测鉴定方法
• 1.6 本论文的研究内容
• 第二章 实时荧光 PCR 法检测乳酸菌
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.1.1 实验菌株
• 2.1.1.2 试剂
• 2.1.1.3 实验仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 实验试剂的制备
• 2.1.2.2 培养基的制备
• 2.1.2.3 乳酸菌的培养及形态观察
• 2.1.2.4 乳酸菌基因组DNA 的抽提方法
• 2.1.2.5 细菌基因组DNA 的电泳检测方法
• 2.1.2.6 乳酸菌引物及探针的设计
• 2.1.2.7 反应体系及反应条件
• 2.1.2.8 特异性实验
• 2.1.2.9 灵敏度实验
• 2.1.2.10 乳酸菌饮料中乳酸菌检测
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 乳酸菌的形态观察
• 2.2.1.1 菌落形态观察结果
• 2.2.1.2 个体形态观察结果
• 2.2.2 五种乳酸菌实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.2.1 植物乳杆菌实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.2.2 干酪乳杆菌实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.2.3 德氏乳杆菌保加利亚亚种实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.2.4 乳酸乳球菌乳脂亚种实时荧光 PCR 检测结果
• 2.2.2.5 嗜热链球菌实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.3 灵敏度实时荧光PCR 检测结果
• 2.2.3.1 植物乳杆菌灵敏度实验结果
• 2.2.3.2 干酪乳杆菌灵敏度实验结果
• 2.2.3.3 德氏乳杆菌保加利亚亚种灵敏度实验结果
• 2.2.3.4 乳酸乳球菌乳脂亚种灵敏度实验结果
• 2.2.3.5 嗜热链球菌灵敏度实验结果
• 2.2.4 酸奶中乳酸菌的检测结果
• 2.3 本章小结
• 第三章 PCR-DHPLC 方法检测乳酸菌
• 3.1 实验材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.1.1 实验菌株
• 3.1.1.2 实验试剂
• 3.1.1.3 实验培养基
• 3.1.1.4 主要仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 乳酸菌的培养
• 3.1.2.2 DNA 的提取
• 3.1.2.3 PCR 条件优化
• 3.1.2.4 DHPLC 条件优化
• 3.1.2.5 DHPLC 检测乳酸菌的研究
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 PCR 条件的优化结果
• 3.2.2 DHPLC 条件优化结果
• 3.2.2.1 柱温优化结果
• 3.2.2.2 流动相梯度优化结果
• 3.2.2.3 流速优化结果
• 3.2.2.4 片段收集及DNA 测序结果
• 3.2.3 DHPLC 检测乳酸菌的研究结果
• 3.2.3.1 重复性实验结果
• 3.2.3.2 灵敏度实验结果
• 3.3 本章小结
• 第四章 结论与展望
• 4.1 研究结论
• 4.2 研究的创新点
• 4.3 本论文有待深入的内容
• 4.4 展望
• 参考文献
• 致谢