牛卵母细胞胞质内显微受精技术研究

论文摘要

本试验研究目的在于探讨牛卵母细胞胞质内显微受精(Intracytoplasmic sperm injection, ICSI)操作中,卵母细胞成熟培养时间、卵母细胞第一极体位置、精子操作液中聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度、精子状态以及受精卵化学激活方法对ICSI卵体外发育的影响。1.在不同条件下进行牛ICSI操作,以ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率验证获试验条件的有效性。体外成熟培养20 h,24 h和28 h的卵母细胞用于ICSI时,ICSI卵的形态完整率分别为94.6 %(175/185), 97.2 %(173/178)和96.4 %(189/196) (P>0.05);成熟培养24 h和28 h的卵母细胞,其ICSI卵的卵裂率(73.4 %和70.9 %)和囊胚发育率(31.8 %和28.6%)显著高于成熟培养20 h的卵母细胞(61.1 %和21.7 %)(P<0.05)。2.对ICSI卵分别采用三种方法进行激活,对照组不进行激活处理。结果表明,ICSI卵不进行激活处理时,卵裂率较低,没有ICSI卵能够发育到囊胚;用乙醇或离子霉素激活时,ICSI卵的卵裂率(51.9 %和56.6 %)和囊胚发育率(14.5 %和17.9 %)显著高于未激活组(15.8 %和0)(P<0.05);用离子霉素和6–二甲氨基嘌呤(6–DMAP)联合激活时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率分别为70.8 %和28.5 %,显著高于乙醇激活或离子霉素激活,以及未激活组(P<0.05)。3.显微注射时将卵母细胞第一极体调整到相当于时钟6点或12点的方向,所获得的ICSI卵的形态完整率(95.1 %和94.0 %)、卵裂率(69.3 %和67.8 %)和囊胚发育率(30.7 %和28.8 %)都无统计学差异(P>0.05)。4.采用含5 %,10 %和15 %PVP的精子操作液处理精子后对成熟培养24 h的卵母细胞进行ICSI操作,PVP浓度为5 %和10 %时,ICSI卵的卵裂率(73.2 %和66.9 %)和囊胚发育率(32.7 %和29.7 %)差异不显著(P>0.05),但二者均显著高于15 %PVP浓度组的卵裂率和囊胚发育率(51.0 %和16.3 %)(P<0.01)。5.对成熟培养24 h的卵母细胞注射获能精子时,ICSI卵的卵裂率和囊胚发育率(72.7%和31.4 %)高于未获能精子组(69.4 %和29.3 %)和不运动精子组(71.5 %和30.4 %),但无统计学差异(P>0.05)。结论认为,选择体外成熟培养24 h的牛卵母细胞进行ICSI操作时,将卵母细胞第一极体位置调整到相当于时钟6点或12点,并使用含5 %PVP的精子操作液进行处理过的获能精子,ICSI卵采用Ionomycin和6–DMAP联合激活,有利于ICSI卵的体外发育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 显微受精国内外研究进展
• 1.1 显微受精国内外研究进展
• 1.1.1 显微受精国外研究进展
• 1.1.2 显微受精国内研究进展
• 1.2 精子胞质内显微受精的基本操作程序
• 1.2.1 固定针和注射针的准备
• 1.2.2 精子胞质内显微受精过程
• 1.2.3 注射卵的激活
• 1.2.4 注射卵体外培养
• 1.3 影响ICSI 成功的因素
• 1.3.1 注射位置
• 1.3.2 精子状态
• 1.3.3 精子发生阶段
• 1.3.4 精子预处理
• 1.3.5 卵子状态
• 1.4 操作系统
• 1.4.1 ICSI 系统与操作
• 1.4.2 显微注射管的直径
• 1.5 其他因素
• 1.6 ICSI 应用前景
• 1.6.1 提高精子利用率，加快良中繁育和推广
• 1.6.2 生产性别控制动物
• 1.6.3 研究精卵之间作用及受精机理
• 1.6.4 生产转基因动物
• 1.6.5 拯救濒危珍稀动物
• 1.6.6 其他方面
• 1.6.7 解决男性不育
• 1.7 ICSI 技术存在的问题
• 1.7.1 成本高，总体效率低，不利于生产推广
• 1.7.2 安全性问题
• 1.7.3 孤雌生殖现象
• 1.7.4 ICSI 精子的选择与遗传
• 第二章 卵母细胞不同成熟时间与激活方式对牛卵母细胞显微受精效果的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 主要仪器设备
• 2.1.2 主要试剂与液体
• 2.1.3 操作液
• 2.1.4 试验操作过程
• 2.1.5 统计分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同成熟培养时间卵母细胞ICSI 卵体外发育结果
• 2.2.2 不同激活方法时ICSI 卵体外发育结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 卵母细胞成熟培养时间对ICSI 卵体外发育的影响
• 2.3.2 不同激活方法对ICSI 卵发育的影响
• 2.4 小结
• 第三章 第一极体位置、PVP 浓度及注射不同精子类型对牛卵母细胞显微受精效果的影响
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 主要试剂与液体
• 3.1.3 操作液
• 3.1.4 试验操作过程
• 3.1.5 统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 显微注射时不同第一极体位置的ICSI 卵体外发育结果
• 3.2.2 不同浓度的PVP 液处理获能精子后ICSI 卵体外发育结果
• 3.2.3 注射不同类型精子的ICSI 卵体外发育结果
• 3.3 讨论
• 3.3.1 显微受精注射时第一极体位置不同对ICSI 卵发育的影响
• 3.3.2 精子处理液中PVP 浓度对ICSI 卵体外发育的影响
• 3.3.3 显微注射不同精子类型对ICSI 卵体外发育的影响
• 3.4 小结
• 结论
• 今后研究方向
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介