当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响及相关细胞信号通路的研究

论文题目: 当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响及相关细胞信号通路的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物医学工程

作者: 陈晓萍

导师: 杜继曾

关键词: 当归,骨髓细胞,单个核细胞,粒单核祖细胞集落,髓过氧化物酶,信号转导子和转录激活子,有丝分裂原激活的蛋白激酶

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本论文研究中药，主要是当归对小鼠骨髓细胞增殖的影响，及对MAPK，JAK—STAT两条细胞信号通路的作用。 论文分为三部分内容。 第一部分是药物的选择和作用条件的优化。根据中药的药性，选择了4种有代表性的药物，即补血药当归，理气药黄芪，滋阴药枸杞和祛风湿药雷公藤。采用这4种药物的制剂，观察对小鼠骨髓细胞增殖的影响。 粒单核祖细胞集落形成及髓过氧化物酶活性测定结果表明，当归和黄芪提取物具有促进粒单核细胞系列增殖的能力。分别检测了0.1mg／ml，1mg／ml，10mg／ml 3个不同剂量，作用有量效关系。当归提取物的作用在10mg／ml剂量较强，能增加CFU-GM形成数73％，MPO比酶活369％；而黄芪提取物的作用在1mg／ml剂量较强，使CFU-GM形成数增加22％，MPO比酶活增加96％。 枸杞中的提取物——枸杞多糖在0.01mg／ml，0.1mg／ml，1mg／ml浓度未检测到对CFU-GM形成数和MPO比酶活的影响。 雷公藤制剂——雷公藤多苷的作用是抑制性的，以0.01mg／ml，0.1mg／ml，1mg／ml三个不同浓度进行研究，1mg／ml剂量作用较强，使CFU-GM形成数下降41％，MPO比酶活下降77％。 根据上述结果，从中选择具有良好促骨髓细胞增殖能力的当归进行作用条件优化，继而进一步深入研究。 以密度梯度离心法从小鼠骨髓中分离出单个核细胞，采用噻唑蓝比色法测定其生长增殖能力。分别对细胞培养第1—7天每日测定，作出细胞生长曲线。结果表明，第3天是明显的快速增殖期，适合于进一步研究。 在新鲜分离的单个核细胞中加入不同浓度的当归注射液，比较细胞生长增殖速度的变化。结果发现，1mg／ml浓度具有较强的作用效果。 常规细胞培养液中的胎牛血清含有多种促进细胞生长的活性因子，可能掩盖药物作用，因此，在短期培养中目前有许多研究采用无血清培养。我们采用10％胎牛血清，5％胎牛血清，无血清3种不同条件的培养液，观察当归的作用。 实验结果表明，无血清条件下当归注射液呈现出明显的促进细胞增殖能力，在作用较强的1mg／ml剂量，能增加单个核细胞增殖444％。而在含10％胎牛血清及5％胎牛血清的培养液，当归的促增殖作用在很大程度上被细胞的背景增殖所掩盖。因此，在后面细胞信号通路的研究中，我们采用无血清或根据方法要求采用背景很低的0.5％血清。 论文的第二部分是当归制剂对单个核细胞增殖中MAPK信号通路的影响。 MAPK细胞信号通路是调节细胞生长增殖的一条重要途径，在细胞内信号传递中起枢纽性作用。它的核心过程是MAPKKK→MAPKK→MAPK的三级传递。MAPK有多种亚型，不同的亚型引起不同的细胞变化。ERK1／2，SAPK／JNK，P38是三种主要的亚型。 MAPK蛋白通过关键位点氨基酸的磷酸化而活化，这种变化可用特异性抗体加以检测。在本文中，采用流式细胞术方法研究MAPK蛋白的活化。

论文目录:

插图目录

表格目录

摘要

Abstract

略语表

第1章 概论：骨髓造血调控的研究进展

1.1 骨髓造血微环境

1.2 造血细胞的增殖和分化过程

1.3 与骨髓造血调控有关的基因

1.3.1 同源盒(Homeobox,Hox)基因家族

1.3.2 GATA基因家族

1.3.3 C／EBP基因家族

1.3.4 Ets基因家族

1.3.5 C-mp1基因

1.3.6 AML1和TAL—1／SCL基因

1.3.7 其它

1.4 JAK-STAT细胞信号转导通路

1.4.1 细胞表面受体家族

1.4.2 JAK家族

1.4.3 STAT家族

1.4.4 JAK-STAT的信号传递过程

1.4.5 STAT转移到核内的机制及基因转录的活化

1.4.6 JAK-STAT信号通路的调节及其关闭机制

1.4.7 其他涉及STAT的通路

1.5 MAPK信号通路

1.5.1 MAPK信号通路的基本结构模件

1.5.2 支架蛋白

1.5.3 MAPK信号通路的激活过程与细胞增殖

1.5.4 MAPK信号通路的三条主要途径

1.5.5 MAPK通路途径网络

1.6 中药在造血调控中的研究现状

1.7 本课题研究的基本内容和目标

第2章 4种中药制剂对小鼠骨髓粒单核祖细胞增殖的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

2.1.2 试剂

2.1.3 仪器、设备

2.1.4 实验动物

2.1.5 骨髓细胞悬液(BMC)的制备

2.1.6 小鼠肺条件培养液(LCM)的制备

2.1.7 小鼠粒单核祖细胞集落(CFU-GM)形成方法

2.1.8 中药提取物的制备

2.1.8.1 当归提取物(AnE)和黄芪提取物(AsE)的制备

2.1.8.2 枸杞多糖(LBP)的制备

2.1.8.3 PH值和渗透压的调整

2.1.8.4 细菌内毒素检测

2.1.8.5 细胞毒性检测(台盼蓝拒染法)

2.1.9 中药制剂对CFU-GM形成的影响

2.1.10 髓过氧化物酶(MPO)活性测定

2.1.11 统计学处理

2.2 结果与分析

2.2.1 中药提取物的得率

2.2.2 细菌内毒素试验

2.2.3 细胞毒性试验

2.2.4 粒单核祖细胞集落形态

2.2.5 中药制剂对CFU-GM集落形成数的影响

2.2.5.1 当归提取物对CFU-GM集落形成数的影响

2.2.5.2 黄芪提取物对CFU-GM集落形成数的影响

2.2.5.3 枸杞多糖对CFU-GM集落形成数的影响

2.2.5.4 雷公藤多苷对CFU-GM集落形成数的影响

2.2.6 中药制剂对MPO活性的影响

2.2.6.1 当归提取物对MPO活性的影响

2.2.6.2 黄芪提取物对MPO活性的影响

2.2.6.3 枸杞多糖对MPO活性的影响

2.2.6.4 雷公藤多甙对MPO活性的影响

2.3 讨论

第3章 不同培养条件下当归注射剂对骨髓单个核细胞增殖的作用

3.1 材料和方法

3.1.1 材料

3.1.2 试剂

3.1.3 仪器、设备

3.1.4 实验动物

3.1.5 骨髓MNC的制备

3.1.6 活细胞计数(台盼蓝拒染法)

3.1.7 当归注射液的pH和渗透压的调整

3.1.8 MNC的培养及药物处理

3.1.9 细胞增殖能力的测定(MTT比色法)

3.1.10 统计学处理

3.2 结果和分析

3.2.1 单个核细胞培养时间的选择

3.2.2 不同浓度当归注射剂对10％FBS培养MNC的影响

3.2.3 不同浓度当归注射剂对5％FBS培养MNC的影响

3.2.4 不同浓度当归注射剂对无血清IMDM培养的影响

3.3 讨论

第4章 当归注射剂对小鼠单个核细胞MAPK信号途径的作用

4.1 材料与方法

4.1.1 材料

4.1.2 试剂

4.1.3 仪器、设备

4.1.4 细胞准备

4.1.5 药物刺激及细胞固定

4.1.6 流式细胞仪检测

4.2 结果与讨论

4.2.1 单个核细胞流式细胞仪参数的测定

4.2.2 当归注射剂对ER1l／2 MAPK的影响

4.2.3 当归注射剂对SAPK／JNK MAPK的影响

4.2.4 当归注射剂对P38 MAPK的影响

4.3 讨论

第5章 MAPK抑制剂对当归促进单个核细胞增殖的影响

5.1 材料和方法

5.1.1 材料

5.1.2 试剂

5.1.3 仪器、设备

5.1.4 MNC的准备

5.1.5 细胞增殖能力的测定

5.1.6 MAPKs抑制试验

5.1.7 统计学处理

5.2 结果与分析

5.2.1 ERK抑制剂对当归注射剂促进MNC增殖的影响

5.2.2 P38抑制剂对当归注射剂促进MNC增殖的影响

5.2.3 SAPK／JNK抑制剂对当归注射剂促进MNC增殖的影响

5.3 讨论

第6章 当归注射液对小鼠骨髓单个核细胞JAK—STAT信号途径的调节作用

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 试剂

6.1.3 仪器、设备

6.1.4 细胞准备

6.1.5 药物刺激及细胞裂解

6.1.6 上样液的蛋白质浓度校正

6.1.7 Western blot

6.2 结果与分析

6.2.1 STAT1在MNC中的表达

6.2.2 当归注射剂对磷酸化STAT1的影响

6.2.3 STAT3在MNC的表达

6.2.4 当归注射剂对磷酸化STAT3的影响

6.2.5 STAT5在MNC的表达

6.2.6 当归注射剂对磷酸化STAT5的影响

6.3 讨论

第7章 分析与讨论

参考文献

重要溶液的配制

论文期间主持的课题

论文期间发表的论文

致谢

独创性声明

发布时间: 2006-09-06

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