乳酸菌产苯乳酸及分离提取的研究

论文摘要

苯乳酸（Phenyllactic acid, PLA）是一种新型的生物防腐剂,首次发现是在Geotrichum candidum中可以抑制Listeria monocytogens的生长。它具有抗革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌等功能。除了在食品中具有抗微生物的功能外,苯乳酸由于是中药提取物“丹参素”的类似物,具有一定的药用价值,因此苯乳酸的开发和利用具有广泛的应用前景。本论文应用实验室已有的可以发酵生产苯乳酸的乳酸菌Lactobacillus sp. SK007,首先在实验室规模下,对发酵生产苯乳酸的培养基在MRS培养基基础上进行改良,并对发酵培养基成分进行优化;然后进行了300 L发酵罐规模的中试发酵论证实验,绘制了发酵过程曲线,分析了发酵液的主要成分;初步找到使用薄层层析色谱的方法来快速检测苯乳酸;在预处理的基础上,采用离子交换树脂、膜分离、溶剂萃取等方法对苯乳酸发酵液的分离纯化进行探索性研究;系统地对活性炭吸附脱色苯乳酸发酵液进行了研究,分析了脱色的工艺以及活性炭吸附的热力学性质。具体研究内容与结果如下:1.以乳酸菌Lactobacillus sp. SK007作为苯乳酸的生产菌株,在单因素分析的基础上,采用均匀设计、二次旋转组合设计等一系列优化实验,确定了最佳培养基的组成和浓度。乳酸菌SK007发酵产苯乳酸的发酵条件为发酵温度为30℃,发酵时间24 h,培养基起始pH 6.2-6.4,培养基成分为30 g/L葡萄糖,5 g/L苯丙酮酸,47 g/L玉米浆,3 g/L磷酸氢二钾,3 g/L乙酸钠,30 g/L酵母粉和3 mL/L吐温-80,实验结果有良好的重现性,苯乳酸产量达到2.30 g/L。在苯乳酸的发酵生产中使用玉米浆作为主要氮源,而取代了蛋白胨,由于节约了成本,提高了发酵法合成苯乳酸工业化生产的可行性。2.进行了300 L发酵罐规模的中试发酵论证实验,根据发酵进程曲线表明,代谢产物的生成与生长是同步的,即生长偶联型。分析了发酵液的主要成分,分别为苯乳酸3.15% （占固形物含量）,灰分15.55% （占固形物含量）,蛋白质34.15% （占固形物含量）。另外,对发酵液中的苯乳酸进行构型分析,结果表明发酵液中L-苯乳酸和D-苯乳酸的比例接近于1:1。3.采用薄层层析色谱法测定苯乳酸,其具体条件为,展开剂及比例为氯仿:甲醇:冰醋酸= 8: 1: 0.1,显色剂为10%硫酸的甲醇溶液和5%磷钼酸的甲醇溶液。4.利用硫酸铝絮凝等方法先对苯乳酸发酵液进行预处理。然后考察了不同的分离纯化手段对苯乳酸发酵液的影响,其中包括离子交换树脂、膜分离以及溶剂萃取等方法。通过研究表明,采用乙酸乙酯萃取分离效果比较明显,通过正交实验得到最终工艺是相比3: 1,pH为1.0,萃取次数4次。在此工艺条件下,PLA占固形物含量为88.12%,PLA回收率为92.61%。5.研究了4种活性炭对发酵液吸附脱色的影响,最终选择AC1为脱色剂,再通过单因素实验和正交实验对脱色条件进行优化,得到了适宜的脱色条件为:活性炭添加量1.5%,发酵液初始pH6.5,温度为90℃,脱色时间为30 min。在此条件下进行进一步实验,结果发现,苯乳酸发酵液的脱色率可达到90.48%,苯乳酸回收率为88.58%。活性炭对苯乳酸发酵液脱色的吸附符合Freundlich （R2 > 0.9597）方程和Langmuir （R2 >0.9656）方程。吸附焓ΔH为-2.45—6.26 kJ/mol,吸附自由能ΔG为-6.98—-10.69 kJ/mol,吸附熵ΔS为12.6—42.3 J/mol·K。活性炭对苯乳酸发酵液中色素的吸附是自发进行的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 苯乳酸的结构及理化性质
• 1.1.1 苯乳酸的结构
• 1.1.2 苯乳酸的溶解度和稳定性
• 1.1.3 苯乳酸的抑菌及药理作用
• 1.1.4 苯乳酸的安全性
• 1.2 国内外的研究现状及应用
• 1.2.1 化学合成法
• 1.2.2 生物合成法
• 1.2.3 分离纯化
• 1.2.4 苯乳酸的应用
• 1.3 苯乳酸的研究背景及意义
• 1.4 本课题的研究的目的和内容
• 第二章 薄层层析色谱法分析苯乳酸的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要实验材料
• 2.2.2 主要实验设备
• 2.2.3 薄层层析色谱的实验步骤及方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 展开剂的选择
• 2.3.2 展开剂浓度的选择
• 2.3.3 显色剂的选择
• 2.3.4 薄层层析色谱在苯乳酸检测中的应用
• 2.4 本章小结
• 第三章 苯乳酸发酵工艺研究及物料分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要实验材料
• 3.2.2 试验仪器
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 培养条件
• 3.2.5 实验方法
• 3.2.6 测定方法
• 3.2.7 数据分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 乳酸菌生长曲线的确定
• 3.3.2 苯乳酸发酵中营养因素主次因素的筛选
• 3.3.3 主要营养因素条件的确定
• 3.3.4 300 L 发酵罐放大试验
• 3.3.5 发酵液成分分析
• 3.3.6 发酵液中苯乳酸的构型分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 苯乳酸发酵液分离纯化的研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要实验材料
• 4.2.2 主要实验设备
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.4 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 絮凝实验及絮凝剂的选择
• 4.3.2 离子交换树脂的分离纯化发酵液
• 4.3.3 膜分离超滤
• 4.3.4 萃取
• 4.4 本章小结
• 第五章 苯乳酸发酵液的脱色工艺及吸附性质的研究
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料及仪器
• 5.2.2 实验方法
• 5.2.3 分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 检测波长的确定
• 5.3.2 活性炭的选择
• 5.3.3 操作条件对脱色效果的影响
• 5.3.4 正交设计确定脱色的最佳工艺条件
• 5.3.5 苯乳酸发酵液脱色体系的热力学性能
• 5.4 本章小结
• 主要结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文