RNA干扰下调cyclin T1蛋白的表达及其对靶细胞和HIV-1的影响

论文题目: RNA干扰下调cyclin T1蛋白的表达及其对靶细胞和HIV-1的影响

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 李朝阳

导师: 郭德银

关键词: 干扰,细胞凋亡,小发夹

文献来源: 武汉大学

发表年度: 2005

论文摘要: RNA干扰(RNAi)是一种由小干扰RNA(siRNA)介导的靶序列特异性RNA降解机制,现在它不仅被当作一种研究工具,还可以用作一种抑制病毒感染的基因治疗策略。在哺乳动物细胞里,基于小发夹RNA(shRNA)的RNA干扰技术可以成功下调细胞或者病毒基因的表达。 我们在HeLa,293T以及U373-MAGI-CCR5e细胞中表达靶向细胞内cyclin T1蛋白的shRNA表达质粒后,发现表达质粒CT-4可以特异的下调细胞内cyclin T1蛋白的表达。同时,我们的结果显示cyclin T1蛋白的下调水平跟转染的shRNA表达质粒的剂量以及转染的时间都有一定的正相关性。 CDK9/cyclin T1这一复合物在细胞内的活性不依赖于细胞周期,其作用是参与转录的延伸。这表明作为这个复合物的一个亚单位的cyclin T1对细胞的存活是至关重要的。但是,我们的实验表明在培养的细胞系中,下调cyclin T1蛋白的表达既没有诱导宿主细胞产生凋亡,甚至没有影响细胞周期的变化。我们的结果与刚刚报道的下调P-TEFb的表达没有引起细胞死亡相一致。在细胞水平,cyclin T1将会是一个很好的抑制HIV-1复制的细胞内靶位点。

论文目录:

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引言

第一章 综述

1.RNA干扰

1.1 RNA干扰的发现与机制

1.1.1 RNA干扰的发现

1.1.2 RNA干扰的机制

1.2 RNA干扰与哺乳动物

1.3 RNA干扰的应用前景

1.3.1 疾病治疗

1.3.2 基因功能的研究

1.3.3 生物进化

1.3.4 干细胞与细胞分化

1.4 siRNA的设计及应用

1.4.1 siRNA的设计

1.4.2 siRNA的制备

1.4.3 siRNA转染中的注意事项

2.细胞凋亡

2.1 细胞凋亡概述

2.1.1 细胞凋亡的概念

2.1.2 细胞凋亡的生理学意义

2.1.3 细胞凋亡的病理学意义

2.1.4 细胞凋亡的形态学变化

2.1.5 细胞凋亡的生化改变

2.2 细胞凋亡的检测方法

2.2.1 DNA降解分析

2.2.2 基于凋亡细胞膜通透性的染包方法

2.2.3 细胞凋亡的相关蛋白分析

2.4.4 细胞凋亡的酶学分析

2.2.5 其他细胞凋亡的检测方法

3.Cyclin T1

3.1 Cyclin T1克隆和表达

3.2 Cyclin T1的生理功能

4.HIV-1

4.1 HIV-1的分子生物学

4.1.1 HIV-1的基因和基本结构

4.1.2 HIV-1的信使RNA(mRNA)

4.1.3 结构蛋白

4.1.4 调控蛋白

4.1.5 酶

4.2 Cyclin T1与HIV-1转录

4.3 RNA干扰在抑制HIV-1复制中的应用

4.3.1 干扰病毒基因的复制

4.3.2 干扰病毒基因调控

4.3.3 干扰宿主细胞相关基因表达

第二章 材料和方法

1.分子生物学实验技术

1.1 质粒DNA的制备和纯化

1.1.1 质粒DNA的小量制备

1.1.2 质粒DNA的大量制备

1.1.3 超纯质粒DNA提取

1.2 限制性酶切消化

1.3 DNA片断的回收

1.3.1 玻璃奶法

1.3.2 试剂盒吲收

1.3.3 DNA片断和载体的连接

1.4 感受态的制备

1.4.1 冷氯化钙法制备新鲜感受态细胞

1.4.2 电转化感受态细胞的制备

1.4.3 高效感受态细胞制备方法

1.5 转化

1.5.1 常规转化法

1.5.2 质粒的快速转化法

1.5.3 质粒的电转化法

1.6 菌种的保存

2.细胞学实验技术

2.1 细胞培养基的配置(以DMEM为例)

2.2 细胞传代培养

2.3 细胞的冻存和复苏

2.3.1 冻存

2.3.2 复苏

2.4 脂质体转染

2.5 流式细胞仪分析细胞亚G1峰

2.6 萤火虫荧光素酶活性的检测

2.7 原位末端标记检测(TUNEL)

2.8 X-gal染色

3.病毒学实验技术

3.1 单复制周期HIV-1病毒粒子的收获及其相对P24浓度的检测

3.2 单周期HIV-1病毒粒子感染U373-MAGI-CCR5E细胞

4.蛋白质化学实验技术

4.1 SDS-PAGE

4.2 Western Blotting

第三章 siRNA下调cyclin T1表达及对靶细胞的影响

3.1 引言

3.2 材料和方法

3.2.1 siRNA的设计及shRNA表达质粒的克隆

3.2.2 细菌、细胞及抗体

3.2.3 细胞的脂质体转染

3.2.4 Western blot检测

3.2.5 流式细胞仪检测亚G1峰

3.2.6 TUNEL标记分析

3.3 研究结果

3.3.1 设计的siRNA序列及shRNA表达质粒的构建和鉴定

3.3.2 Western blot实验分析cyclin T1蛋白表达水平

3.3.3 下调cyclin T1的表达对靶细胞的影响

3.4 讨论

第四章 cyclin T1蛋白的下调对HIV-1复制的影响

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 质粒、细胞和试剂盒

4.2.2 HIV-1单周期病毒粒子的获得及其p24相对浓度的测定

4.2.3 单周期病毒粒了感染U373-MAGI-CCR5e细胞

4.2.4 荧光素酶活性的测定

4.2.5 X-gal染也

4.3 结果

4.3.1 cyclin T1蛋白的表达水平对HIV-1前病毒质粒复制的影响

4.3.2 单周期HIV-1病毒粒了的获得及p24相对浓度的测定

4.3.3 cyclin T1蛋白的表达水平对病毒感染早期的影响

4.3.4 cyclin T1蛋白的表达水平对HIV-1 LTR活性的影响

4.4讨论

总讨论

参考文献

在读期间发表和待发表的论文

致谢

发布时间: 2006-03-27

参考文献

• [1].人工设计的PPR蛋白特异识别靶标RNA的机制研究[D]. 申翠翠.华中农业大学2018
• [2].Paraspeckles促进pri-miRNA加工的机制研究[D]. 姜黎.武汉大学2017
• [3].RNA干扰在哺乳动物抗野田村病毒先天性免疫作用机制研究[D]. 樊晓旭.中国农业大学2015
• [4].RNA结合蛋白HLP1与HLP2调控拟南芥开花时间的分子机理研究[D]. 侯毅枫.山东农业大学2016
• [5].RNA结合蛋白在基因转录、剪接及miRNA反馈回路中调控的信息学研究[D]. 黄捷.武汉大学2014
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• [10].小干涉RNA递送方法的研究[D]. 党颖.重庆医科大学2005

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