凡纳滨对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力调控的研究

论文摘要

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）是全世界三大养殖对虾中单位产量最高的虾种。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-Acetyl-β-D-glucosaminidase,简称NAGase,EC.3.2.1.52）在对虾的蜕壳发育和营养代谢中发挥着重要作用。因此,研究凡纳滨对虾在患病过程的酶学变化,探讨环境污染物、饲料添加剂、水产养殖常用药物等对NAGase活力的影响与调控,以及对虾活体急毒性试验的开展,探究重金属离子对凡纳滨对虾NAGase活力的影响,将有利于对虾养殖业发展,为对虾养殖水环境污染监测提供更加充分、直观的科学依据,并填补国内外在这方面的研究空白。本文以凡纳滨对虾壳膜与内脏所提NAGase为对象,展开以下几方面的研究。（1）跟踪考察分析健康和患红体病的凡纳滨对虾壳膜与内脏NAGase的活力和性质的差异。测得健康对虾壳膜NAGase的活力为34.80 U/mg,内脏NAGase的活力为35.34 U/mg;而患红体病对虾壳膜NAGase的活力为38.32 U/mg,内脏NAGase的活力为20.02 U/mg。结果表明:两种来源对虾的NAGase活力、基本酶学性质等均存在差异。对虾患红体病后,壳膜与内脏NAGase的催化反应动力学常数Km和Vm值、活化能均较高,但其最适温度较低,pH稳定性及热稳定性较差。同时,对虾患病前后,壳膜与内脏来源的NAGase对外界各影响因子(Hg2+、Zn2+、Cu2+、Cd2+、pb2+、Al3+等重金属离子污染物:乙醇、甲醛、苯酚、甲醇、二氧六环、DMF、DMSO等有机污染;脲、NBS、SDS等常用化学修饰剂及变性剂)的敏感性也发生了变化。（2）养殖水体常用消毒药物中,次氯酸钠、三氯异氰尿酸、季氨盐对凡纳滨对虾壳膜与内脏来源的NAGase的活力有不同程度的影响。同时,次氯酸钠、三氯异氰尿酸对两种来源的酶的抑制为不可逆过程。青霉素钾、链霉素、庆大霉素、卡那霉素等对壳膜与内脏来源的NAGas活力基本上没有影响;养殖常用的内服、外用抗菌药物中,盐酸环丙沙星对两种来源的酶有激活作用,而诺氟沙星和磺胺甲嗯唑对酶活力则有不同程度的抑制作用。磺胺甲嗯唑对壳膜NAGase表现为混合型可逆抑制,对内脏来源的NAGase表现为非竞争性抑制;诺氟沙星对内脏来源的NAGase为混合型可逆抑制。考察几种养殖常用维生素对内脏NAGase活力的影响,其中VB12、烟酸、核黄素等对酶活力基本上没有影响;而VB1、VB6、抗坏血酸等对该酶活力均有不同程度的抑制作用,进一步研究了VB6的抑制作用动力学,其对酶的抑制作用为非竞争性可逆抑制。（3）对凡纳滨对虾进行养殖试验,研究重金属离子对对虾NAGase活力影响,在不同时间取样并考察Cu2+、Zn2+、Cd2+、Pb2+、Hg2+等重金属离子对凡纳滨对虾壳膜及内脏NAGase活力的影响。结果显示5种重金属离子低浓度组在短时间内对凡纳滨对虾壳膜与内脏的NAGase活力没有显著影响,48h后随作用时间的延长,重金属离子使两种来源的NAGase活力均逐渐降低,表现为显著性抑制的剂量效应关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1.1 凡纳滨对虾概况及养殖
• 1.1.1 凡纳滨对虾简介
• 1.1.2 对虾养殖现状与存在问题
• 1.1.2.1 对虾主要疾病及防治手段、诊断方法
• 1.1.2.1.1 对虾的主要疾病
• 1.1.2.1.2 对虾桃拉综合症病毒病（TUARA）的研究现状
• 1.1.2.1.3 对虾疾病的防治手段
• 1.1.2.2 重金属污染概述
• 1.2 几丁质与几丁质酶系的研究概况
• 1.2.1 几丁质简介
• 1.2.2 几丁质酶系的研究概况
• 1.2.2.1 几丁质酶
• 1.2.2.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶
• 1.2.3 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的应用研究及对凡纳滨对虾的意义
• 1.3 本论文的研究意义与研究内容
• 第二章 实验材料、仪器与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 蛋白质浓度的测定
• 2.3.2 酶活力和比活力的测定
• 2.3.3 酶的分离纯化
• 2.3.3.1 凡纳滨对虾内脏酶、壳膜酶的分离纯化
• 2.3.3.2 不同生长期和患红体病凡纳滨对虾粗酶的提取
• 2.3.4 酶催化反应的动力学性质研究
• 2.3.4.1 酶催化pNP-NAG水解的动力学参数测定
• 2.3.4.2 酶催化pNP-NAG水解反应的活化能测定
• 2.3.4.3 酶催化反应最适pH的测定
• 2.3.4.4 酶催化反应最适温度的测定
• 2.3.4.5 酶的pH稳定性测定
• 2.3.4.6 酶的热稳定性测定
• 2.3.5 效应物对酶活力的影响
• 2.3.5.1 金属离子对酶活力的影响
• 2.3.5.2 有机溶剂、有机污染物对酶活力的影响
• 2.3.5.3 养殖药物对酶活力的影响
• 2.3.5.4 效应物对酶活力的抑制动力学测定
• 2.3.6 重金属离子对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2.3.6.1 重金属离子梯度的设置
• 2.3.6.2 数据的处理和分析
• 第三章 实验结果
• 3.1 健康虾与患红体病虾的NAGase的比较
• 3.1.1 健康虾与患红体病虾的粗NAGase比活力比较
• 3.1.2 健康虾与患红体病虾的NAGase基本性质比较
• 3.1.2.1 健康虾与患红体病虾的壳膜和内脏NAGase的最适pH比较
• 3.1.2.2 健康及患红体病虾的壳膜和内脏NAGase的pH稳定性比较
• 3.1.2.3 健康与患红体病对虾的壳膜和内脏NAGase的最适温度比较
• 3.1.2.4 健康与患红体病对虾的壳膜和内脏NAGase的热稳定性比较
• 3.1.2.5 健康与患红体病对虾的壳膜和内脏NAGase催化pNP-NAG水解的动力学参数的测定
• 3.1.2.6 健康与患红体病对虾的壳膜和内脏NAGase的活化能比较
• 3.1.3 几种金属离子对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 2+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.1 Cu²⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 2+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.2 Zn²⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 2+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.3 Hg²⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 2+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.4 Cd²⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 2+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.5 Pb²⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3+对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较'>3.1.3.6 Al³⁺对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4 几种有机溶剂对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.1 乙醇对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.2 甲醛对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.3 苯酚对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.4 甲醇对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.5 二氧六环对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.6 DMF对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.4.7 DMSO对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.5 几种变性剂对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.5.1 NBS对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.5.2 SDS对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.1.5.3 Urea对健康虾与患红体病虾的NAGase活力影响比较
• 3.2 对虾养殖常用药物对酶的影响及动力学研究
• 3.2.1 消毒药物对酶活力的影响
• 3.2.1.1 氯制剂类消毒药物对酶活力的影响与抑制机理的研究
• 3.2.1.2 季铵盐类消毒药物对酶活力的影响
• 3.2.1.3 戊二醛对酶活力的影响
• 3.2.2 几种抗生素类药物对酶活力的影响
• 3.2.3 几种内服抗菌药物对酶活力的影响
• 3.2.3.1 盐酸环丙沙星对酶活力的影响
• 3.2.3.2 诺氟沙星对酶的抑制类型与抑制常数
• 3.2.3.3 磺胺甲噁唑对酶的抑制类型与抑制常数
• 3.2.3.4 磺胺嘧啶对酶活力的影响
• 3.2.4 维生素对酶活力的影响
• 1和VB₆对对虾NAGase活力的影响'>3.2.4.1 VB₁和VB₆对对虾NAGase活力的影响
• 3.2.4.2 抗坏血酸对对虾NAGase活力的影响
• 6对酶的抑制类型与抑制常数'>3.2.4.3 VB₆对酶的抑制类型与抑制常数
• 3.3 重金属离子对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2+对凡纳滨对虾NAGase活力的影响'>3.3.1 Cu²⁺对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2+对凡纳滨对虾NAGase活力的影响'>3.3.2 Zn²⁺对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2+对凡纳滨对虾NAGase活力的影响'>3.3.3 Cd²⁺对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2+对凡纳滨对虾NAGase活力的影响'>3.3.4 Pb²⁺对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 2+对凡纳滨对虾NAGase活力的影响'>3.3.5 Hg²⁺对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 第四章 讨论
• 4.1 凡纳滨对虾NAGase的分离纯化
• 4.2 健康虾与患红体病虾的壳膜和内脏NAGase的比较
• 4.3 对虾养殖常用药物对酶的影响
• 4.4 重金属离子对凡纳滨对虾NAGase活力的影响
• 结论
• 参考文献
• 已发表与已接受研究论文
• 致谢