论文摘要
当植物吸收了过多的光能,而不能被光合电子传递途径有效利用时,过剩光能就会降低光合效率从而导致光抑制,甚至光氧化破坏。除了在强光条件下会发生光抑制,在低温弱光等逆境条件下植物由于碳同化能力降低对光能的利用减少,也会产生过剩光能从而导致光抑制。为了避免或减少光抑制,高等植物体内存在着多种防御机制,其中叶黄素循环被认为是在环境胁迫下保护植物光合机构免受过剩光能破坏的一种重要的机制。叶黄素循环是指植物吸收的光能过剩时,双环氧的紫黄质（V）在紫黄质脱环氧化酶（VDE）的催化下,经过中间物单环氧的花药黄质（A）转化为无环氧的玉米黄质（Z）;在暗处,则在玉米黄质环氧化酶（ZE）的作用下朝相反的方向进行,将Z重新环氧化为V,形成一个循环。依赖于叶黄素循环的非光化学猝灭（NPQ）能够保护植物光合机构免受过剩激发能的破坏。有过剩光能存在时,由紫黄质（V）脱环氧化而积累的玉米黄质（Z）也被人们普遍认为对光合机构起到至关重要的保护作用。本研究从番茄叶片中分离到番茄玉米黄质环氧化酶基因,并对该基因的表达和功能进行了分析。结果表明,该基因的表达并不受光强和温度的诱导,而受昼夜节律的影响。过量表达该基因可增强番茄植株对光抑制的敏感性,而抑制该基因表达可减轻番茄植株在低温弱光胁迫下的光抑制程度,影响番茄花的颜色。主要结果如下:1.利用同源序列设计简并引物,通过RT-PCR的方法从番茄叶片克隆到玉米黄质环氧化酶基因的中间片段,通过5’-RACE和3’-RACE分别克隆到5’和3’片段,拼接后设计特异引物扩增到全长cDNA。命名为LeZE（EF581828）。该基因全长为2437bp,ORF为2010bp,编码669个氨基酸,分子量约为73 kDa。同源序列比较发现,番茄玉米黄质环氧化酶基因的序列与马铃薯、烟草、胡萝卜、葡萄的玉米黄质环氧化酶基因的序列同源性较高。结构同源性分析表明LeZE有四个序列保守的结构域,block I和block II为脂质蛋白运载家族的特征区域,block III是黄素蛋白单加氧酶区域以及block IV的FHA结合区域,它们组成了一个重要的催化位点。2. Northern杂交结果表明,LeZE基因在番茄不同器官中呈非特异性表达,在叶绿素含量高的组织中表达量较高。同时,该基因在低温弱光和强光处理的24小时昼夜循环中都存在着相似的昼夜节律的表达模式,并不受温度和光强的影响。Southern杂交结果表明,LeZE基因在番茄基因组中是单拷贝的。3.将获得的LeZE基因与含有35S启动子的pBI121载体重组,分别构建了正义和反义表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化番茄,用PCR及Northern杂交的方法对带卡那抗性的转基因番茄植株进一步检测,结果证明成功地获得了转正义和反义基因的番茄植株。与野生型植株相比,过量表达LeZE基因的番茄叶片中A和Z的含量降低,而V的含量增加,脱环氧化状态较野生型低。LeZE基因表达发生沉默的番茄植株中Z大量积累,而A和V的含量非常低,脱环氧化状态保持非常高的水平。4.构建了原核表达载体pET-LeZE,并在大肠杆菌BL21中表达融合蛋白,将强诱导带切下,溶于PBS获得抗原,免疫小白鼠,其抗血清效价为1: 500。Western杂交表明,转正义植株中LeZE基因已在蛋白水平过量表达。另外分别对低温弱光和强光处理的野生型番茄进行了Western杂交分析。结果表明,LeZE在蛋白水平的表达始终处在稳定的水平,基本不受光强和温度的影响。5.在低温弱光（4℃,100μmol m-2 s-1）和强光（1200μmol m-2 s-1）胁迫条件下,野生型和转正义基因株系T1-1和T1-10株系的NPQ及叶黄素循环脱环氧化状态（A+Z）/（V+A+Z）都增加,但野生型的增加更为明显。在低温弱光及强光胁迫条件下,依赖叶黄素循环的NPQ能够耗散过剩激发能,而转基因株系比野生型耗散能力下降。强光处理过程中,与野生型相比转正义基因株系的Fv/Fm降低更明显,且野生型的Fv/Fm恢复较快,转基因株系的Fv/Fm恢复较慢,野生型番茄的Fv/Fm可以在24 h内恢复,而T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在24 h时分别恢复了93.7%和94.1%。与在强光下类似,T1-1和T1-10株系的Fv/Fm在低温胁迫过程中降低的程度比野生型大,而恢复较慢,恢复12 h时野生型的Fv/Fm完全恢复,但转基因株系24 h才完全恢复。这表明LeZE的过量表达加重了PSII的光抑制程度,与野生型相比,转基因番茄的PSII反应中心受伤害较严重。强光胁迫6 h和12 h,野生型和转基因番茄的放氧速率降低非常显著,低温弱光处理6 h和12 h,野生型和转基因番茄的放氧速率也都降低,但下降程度不如强光处理下的明显。这表明由于LeZE的过量表达降低了低温弱光和强光胁迫下放氧复合体的稳定性,使光合机构所受到的伤害加重。在低温弱光处理过程中转正义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,且区别不大。经过12 h的处理,T1-1,T1-10和野生型的O2含量分别增加了82.1 %,76.8%和66.5 %, H2O2含量分别增加了93.4%,87.8 %和80.3 %。转基因株系中O2和H2O2含量增加的程度明显高于野生型。另外,在低温处理过程中,转正义基因植株和野生型的MDA含量都增加,但转正义基因植株的MDA含量增加的较多。6.在田间生长的番茄野生型和转基因植株经过长期强光适应,它们的放氧和叶绿素a/b比在弱光下生长的野生型和转基因植株高,而总叶绿素含量比弱光下低。转正义基因与野生型之间的差别不大。这些结果表明,在强光下生长的番茄植株比弱光下生长番茄植株有更强的光合能力和较小的捕光天线,以适应强光条件。在夏季正午1980μmol m-2 s-1的光下,野生型和转正义基因植株的最大光化学效率（Fv/Fm）和实际光化学效率（ΦPSII）没有差别。两个转正义基因株系的脱环氧化状态均低于野生型植株,但是与野生型相比,转基因株系有较高的总抗坏血酸含量。另外转基因株系中SOD的活性也要高于野生型。APX的活性在野生型和转基因植株中基本没有差异。7.抑制LeZE的表达不影响过剩光能胁迫下的NPQ。在转反义基因植株中Z大量积累而V和A的含量非常低。在强光和低温弱光胁迫后,转反义基因植株脱环氧化状态始终保持很高的水平。在强光和低温胁迫过程中野生型和转反义基因植株的NPQ都上升,但两者的NPQ基本没有差别。这表明Z在PSII热耗散中可能不起决定性的作用。8.在强光胁迫下野生型和转反义基因植株的放氧速率和Fv/Fm都降低,但是野生型与转反义基因植株间没有差别。在低温弱光胁迫12 h后野生型和转反义基因植株的放氧速率都降低,但野生型降低的更为明显。12 h胁迫后野生型,（-）1和（-）5植株的放氧速率分别下降到原来的42.3 %,60.8 %和58.7 %。低温弱光胁迫下野生型与转反义基因植株的Fv/Fm均下降野生型下降更为明显。低温胁迫12 h后野生型,（-）1和（-）5的放氧速率分别下降了10.5 %,7.1 %和7.9 %。在低温弱光处理过程中转反义基因植株与野生型的氧化态P700都降低,野生型植株P700的下降更为显著。野生型和转反义基因植株的SOD和APX活性在低温弱光处理前6个小时内先有所上升,之后开始下降,野生型和转反义基因植株间酶活性差别不大。但是野生型植株中O 2和H2O2含量明显高于转反基因株系。低温处理后,（-）1,（-）5和野生型植株中O 2含量分别增加了37.6%,42.5%和82.7%,H2O2含量分别增加了39.5%,37.9%和84.8%。经低温弱光处理后,野生型和转反义基因植株中MDA含量都增加,野生型中MDA含量增加更为显著,低温胁迫12小时后野生型,（-）1和（-）5中MDA含量分别增加到131.5 %,110.8 %和115.7%。另外转反义基因植株的成熟花瓣的颜色比野生型苍白,这是由于转反义基因植株花冠上大量积累Z而缺少像V和N这样的环氧叶黄素。综上所述,LeZE的表达不受温度和光强的调控,而受昼夜节律的影响。过量表达该基因增强了PSII对光抑制的敏感性,但在田间强光下生长的转正义基因植株经长期光光适应后与野生型生长差别不大。抑制该基因的表达对过剩光能胁迫下的NPQ没有影响,但是能够减轻低温弱光胁迫下的光抑制。