基于沙门氏菌FabI和黄单胞菌GlmU结构的靶酶抑制剂筛选

论文摘要

传统的药物设计和研发耗资大、周期长且效率低；计算机辅助药物设计的发展大大减少了药物研发中的资金投入,降低了寻找新药的盲目性和偶然性,缩短了药物研发的周期。本研究借助计算机辅助药物设计方法进行了基于肠炎沙门氏菌（Salmonella enterica）烯酰-ACP还原酶（enoyl-ACP reductase, ENR）和水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（N-Acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase, GlmU）结构的靶酶抑制剂筛选。S. enterica是导致食源性疾病爆发的的主要病原菌,严重影响公众的安全。脂肪酸生物合成（Fatty acid biosynthesis, FAS）为细菌生物膜的形成提供必需的前体,在细菌生物膜的形成过程中起着不可替代的作用。ENRs作为催化FAS的关键酶,是一个非常理想的药物筛选靶标。本研究进行了基于S. enterica ENR （SeFabI）结构的抑制剂的虚拟筛选和研究：中药小分子luteolin,对SeFabI抑制效果较好的,IC50为15.6±0.5μmol/L。抑制动力学显示luteolin是底物crotonyl-CoA的反竞争性的抑制剂,抑制常数为15.1±0.3μmol/L。克隆表达了SeFabI[G93V]、SeFabI[G93S]和SeFabI[Y156F]三个突变酶来研究luteolin对SeFabI的抑制机理。SeFabI[G93V]和SeFabI[G93S]催化活性与野生型相比没有明显的差别,而SeFabI[Y156F]则完全失去了催化活性；与野生型相比,SeFabI[G93V]对triclosan和luteolin都显示了较高的抗性；SeFabI[G93S]对triclosan显示较高的抗性,而对luteolin的抑制更敏感。luteolin是从植物中提取的中药成分,其具有高效、低毒性等特性,是一个很好的SeFabI靶酶抑制剂先导化合物,值得进一步研究。由X. oryzae pv. oryzae引起的细菌白叶枯病是造成水稻大量减产的一种最主要的原因。关于glmU基因敲除的报道表明GlmU是细菌细胞壁合成的关键酶,是研发全新抗生素药物的一个很具有吸引力的新靶标。本研究中定点突变及酶活性测试显示Gly13、Arg17、Lys24和Asp105为XooGlmU活性位点的关键氨基酸；并在此基础上进行了基于XooGlmU结构的抑制剂的虚拟筛选和研究；筛选到对XooGlmU抑制效果较好的4个化合物,IC50值在0.5-10μmol/L范围内。抑制动力学表明,这4个化合物都是底物GlcNAc-1-P的竞争性抑制剂,是底物UTP的反竞争性抑制剂,抑制常数最小可达0.2μmol/L。3号和4号化合物对X. oryzae pv. oryzae具有较好的抑菌效果,MIC值分别为75和5μg/mL。这是首次筛选到既能抑制GlmU,而且又具有抑菌效果的小分子化合物。本研究结果为GlmU抑制剂的进一步研究提供了很好的化合物结构骨架。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 肠炎沙门氏菌烯酰-ACP还原酶（SeFabI）抑制剂的筛选及抑制机理研究
• 1.1 前言
• 1.1.1 肠炎沙门氏菌及其危害
• 1.1.2 计算机辅助药物设计和药物筛选靶标的选择
• 1.1.3 细菌脂肪酸合成途径（Fatty acid synthesis,FAS）
• 1.1.4 烯酰-ACP还原酶（Enoyl-ACP reductase,ENRs）
• 1.1.5 以FAS-Ⅱ途径为靶标的抗菌物质研究现状
• 1.1.6 研究目的及意义
• 1.2 材料和方法
• 1.2.1 材料
• 1.2.1.1 菌株、质粒和引物
• 1.2.1.2 主要试剂与耗材
• 1.2.1.3 主要溶液配制
• 1.2.1.4 主要仪器
• 1.2.2 方法
• 1.2.2.1 肠炎沙门氏菌fabI基因的克隆
• 1.2.2.2 SeFabI的表达及纯化
• 1.2.2.3 SeFabI的定点突变
• 1.2.2.4 同源模建及模型评价
• 1.2.2.5 分子对接和基于SeFabI结构的虚拟筛选
• 50值和K_i值测定'>1.2.2.6 抑制剂先导化合物对SeFabI的IC₅₀值和K_i值测定
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 同源模建及结构评价
• 1.3.1.1 模型的建立
• 1.3.1.2 模型的评价
• 1.3.2 分子对接分析
• 1.3.3 虚拟筛选
• 1.3.4 肠炎沙门氏菌fabI基因的克隆以及蛋白的表达和纯化
• 1.3.5 候选化合物的体外抑制活性测试
• 1.3.6 Luteolin作用机理研究
• 1.3.6.1 Triclosan的抑制类型
• 1.3.6.2 Luteolin的抑制类型
• 1.3.6.3 定点突变及突变酶的酶促动力学
• 1.3.6.4 Triclosan抑制机理研究
• 1.3.6.5 Luteolin抑制剂作用机理研究
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 水稻黄单胞菌N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷酰转移酶（GlmU）抑制剂的设计和筛选
• 2.1 前言
• 2.1.1 水稻黄单胞菌及其危害
• 2.1.2 GlmU是一个理想的药物筛选靶标
• 2.1.3 以GlmU为靶标的抗菌物质研究现状
• 2.1.4 研究目的及意义
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌株、质粒和引物
• 2.2.1.2 主要试剂与耗材
• 2.2.1.3 主要溶液的配制
• 2.2.1.4 主要仪器
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 水稻黄单胞菌glmU基因克隆及蛋白的表达和纯化
• 2.2.2.2 水稻黄单胞菌GlmU（XooGlmU）的酶活性的测定
• 2.2.2.3 XooGlmU的酶促动力学分析
• 2.2.2.4 XooGlmU的定点突变
• m值测定'>2.2.2.5 突变XooGlmU对底物K_m值测定
• 2.2.2.6 同源模建、分子对接和虚拟筛选
• 50值、K_i值和MIC值测定'>2.2.2.7 抑制剂先导化合物的IC₅₀值、K_i值和MIC值测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 同源模建、模型评价以及虚拟筛选
• 2.3.2 水稻黄单胞菌glmU基因的克隆及蛋白的表达和纯化
• 2.3.3 XooGlmU体外酶活性方法建立
• 2.3.3.1 孔雀石绿-钼酸铵显色法测定XooGlmU酶的活性
• 2.3.3.2 HPLC法测定XooGlmU酶的活性
• 2.3.4 XooGlmU的酶促动力学分析
• 2.3.4.1 UDP-GlcNAc标准曲线
• 2.3.4.2 XooGlmU的最适反应温度
• 2.3.4.3 XooGlmU的最适pH
• 2+浓度'>2.3.4.4 XooGlmU的最适Mg²⁺浓度
• m'>2.3.4.5 XooGlmU对底物的K_m
• 2.3.5 XooGlmU定点突变
• 2.3.6 XooGlmU突变酶的酶促动力学分析
• 50值、K_i值和MIC值'>2.3.7 抑制剂先导化合物筛选及其IC₅₀值、K_i值和MIC值
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 总结与展望
• 3.1 总结
• 3.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 硕士在读期间已发表或待发表论文