论文摘要
目的:通过转染p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞,观察转染HPV16 E6基因前后两种细胞内P53蛋白及其功能相关蛋白的变化,探讨HPV16 E6对p53Arg72Pro不同基因型的P53蛋白及其功能相关蛋白表达的影响,为研究宫颈癌的致癌机制提供理论依据。方法:构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6,并用脂质体法将pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6分别转染p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞,通过免疫细胞化学方法对转染HPV16 E6前后的p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞内P53、P21、Bax、Ki-67蛋白进行检测。结果:（1）经过PCR、酶切、回收及连接等分子克隆技术成功构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6。（2）将真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6成功转染p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞。（3） p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞转染空载体后P53Arg和P53Pro蛋白的表达量分别为0.821±0.019 OD和1.052±0.010 OD与未转染组的0.899±0.040 OD和1.074±0.015 OD相比差异无统计学意义（P值分别为0.185,0.229）;转染E6组P53Arg和P53Pro蛋白的表达量分别为0.604±0.043 OD和1.006±0.008OD均比未转染组低,差异有统计学意义（P值分别为0.000,0.001）。而且P53Arg蛋白降低趋势比P53Pro蛋白更明显。（4） P21蛋白在p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞中表达量均较低甚至不表达;HPV16 E6作用后,P21蛋白的表达量也没有明显变化。（5） p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞转染空载体后,Ki-67蛋白阳性率分别为81.48 %和81.14%,与未转染组的Ki-67蛋白阳性率80.26%和79.66%相比差异无统计学意义（P值分别为0.624,0.462）;转染E6组p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞内Ki-67表达均增高,分别为86.73%和87.89%,与未转染组相比差异有统计学意义（P值分别为0.047,0.016）。p53Pro纯合型细胞内Ki-67蛋白增高趋势比p53Arg纯合型细胞明显。（6） p53Arg纯合型和p53Pro纯合型细胞转染空载体后,Bax蛋白的表达量分别为0.292±0.004 OD和0.412±0.031 OD,与未转染组的0.297±0.013 OD和0.416±0.025OD相比差异无统计学意义;转染E6组p53Arg纯合型细胞内Bax蛋白的表达量为0.296±0.009 OD比未转染组的0.297±0.013 OD仅轻微降低,差异无统计学意义（P值为0.958）;p53Pro纯合型细胞内Bax蛋白的表达量为0.332±0.013 OD,与未转染组相比降低明显,差异有统计学意义（P值为0.023）。结论:（1）成功构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6。（2）将真核表达载体pcDNA3.1/myc-His（-） A-HPV16 E6转染p53Arg纯合型和p53 Pro纯合型细胞后,在两株细胞内P53蛋白表达均降低,提示P53Arg蛋白和P53Pro蛋白可能均被HPV16 E6蛋白降解,其中P53Arg蛋白降解作用更明显。（3）在两株细胞内P53Arg蛋白和P53Pro蛋白被HPV16E6蛋白降解后,二者抑制细胞增殖能力降低的程度和诱导细胞凋亡能力降低的程度不同,可能通过不同机制导致宫颈癌的发生:①Ki-67表达增高,提示细胞增殖活性增高,其中P53Pro蛋白降解后细胞增殖活性增高较明显;②Bax蛋白表达降低,提示细胞诱导凋亡能力降低,其中P53Pro蛋白降解后细胞诱导凋亡能力降低较明显;③P21蛋白的表达量没有明显变化,提示这两种蛋白对p21基因转录激活均没有明显的影响。
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