与表皮毛发育相关的MYB家族基因对转基因烟草花色的影响

论文摘要

表皮毛是大部分植物地上部分表皮组织所特有的一种结构。不同植物、同一植物不同器官表面覆盖的表皮毛形态、结构以及分布都各不相同。在植物分子生物学领域,表皮毛是研究植物细胞分化调控的一种非常有用的模式,其形态发生与其周围的表皮细胞明显不同,而且,起源和发育也由于具有特殊性而易于观察。本研究从编码与表皮毛发育相关的MYB类转录因子的基因着手,分别构建了超量表达载体和RNA干涉（RNAi）载体,将它们转化烟草受体,分析和鉴定这些基因对转基因植株的叶片表皮毛,根毛以及花色的影响,探讨这些基因在不同植物种类中所扮演的相同或不同的角色和作用,为利用MYB类转录因子对观赏植物进行分子育种改造提供可靠的理论依据和新的基因资源。主要结果如下：1.根据拟南芥和棉花中已知的与表皮毛发育相关的MYB基因分别构建了超量表达载体和RNAi载体。搜索棉花,金鱼草中与表皮毛发育相关的MYB基因,经生物信息学分析,从矮牵牛EST数据库中筛选出得分较高的片段,用RT-PCR的方法从矮牵牛中扩增得到目标序列,分别构建了RNAi载体。通过农杆菌介导将这些植物表达载体转化烟草,对转基因植株进行了阳性检测和表型观察,获得了1个观赏性状有明显改变的转基因群体,并对该基因（AtCPC）进行了进一步的功能分析。2.在AtCPC的超量表达转基因烟草群体及其后代中,花冠部分的颜色局部或全部缺失,不同家系的花朵表现出了不同程度的变化。3.将AtCPC的干涉载体以AtCPC超量表达转基因烟草群体中开纯白色花朵的植株为受体材料,进行二次转化。二次转化的转基因植株表型得到了回复。这个结果有力地证明了AtCPC超量表达转基因烟草花朵颜色的改变确实是由于外源基因AtCPC的插入而导致的。4.对AtCPC超量表达转基因烟草T2代小苗的根毛在体式镜显微镜进行了观测和拍照。对T1代成熟的转基因植株叶片上的表皮毛在电子显微镜下进行了扫描和拍照,并分别对长柄腺毛和短柄腺毛的数量进行了统计。分析发现AtCPC超量表达对转基因烟草的叶片表皮毛和根毛的分布密度也有影响。5.利用石蜡切片和扫描电镜对AtCPC超量表达转基因烟草的花瓣表皮细胞进行了观察。结果显示,不同家系的花瓣表皮细胞形状发生了不同程度的变异,并且表皮细胞形状的变异程度似乎也与花色变化强弱的程度有着某种相关性。6.提取AtCPC超量表达转基因烟草花瓣中的花青素和黄酮醇,分别采用分光光度仪和高效液相色谱仪对含量进行了测定。与野生型相比,转基因植株花瓣中的黄酮醇含量变化不大,而大部分转基因植株花瓣中的花青素含量有所降低,其中开白色花的家系降低幅度最为剧烈,降幅高达63.03%。7.对AtCPC超量表达转基因烟草T0和T1代群体中AtCPC基因的表达量进行检测的结果表明：转基因植株花色表型的强弱与导入的外源基因AtCPC表达量的高低有着直接的相关性。对AtCPC抑制表达载体二次转化转基因烟草中AtCPC基因的表达水平也进行了分析,结果再次证实了我们得到的结论：即AtCPC的表达量越高,表型越明显,反之亦然。8.对烟草中与花色素合成相关的7个结构基因的表达量进行了分析。结果显示,主要是处于类黄酮合成路径下游的,与花青素合成直接相关的3个基因（NtDFR, NtANS和Nt3GT）的表达受到了AtCPC的负调控。9.搜索了部分已克隆的与花青素生化途径相关的非结构基因,选取了AN1, AN9, AN11和JAF13这几个矮牵牛基因,通过酵母双杂交实验来分析它们编码的蛋白与AtCPC之间可能存在的相互作用。通过菌落在选择培养基上的生长情况和β-galactosidase酶活性的检测,我们判断AtCPC与AN1、JAF13这两个bHLH蛋白之间存在着相互作用。这一系列的结果表明AtCPC在烟草中又扮演了一个新的角色：参与类黄酮次生代谢的调节因子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 转录因子概述
• 1.1.1 转录因子的结构特征
• 1.1.2 转录因子的分类及功能
• 1.2 研究植物基因功能的主要策略
• 1.2.1 基因功能缺失突变
• 1.2.1.1 反义抑制和共抑制
• 1.2.1.2 插入突变
• 1.2.1.3 RNA干扰
• 1.2.2 基因功能获得性突变
• 1.2.2.1 基因超量表达
• 1.2.2.2 基因诱导表达
• 1.2.2.3 基因异位表达
• 1.3 研究基因功能的其他方法
• 1.3.1 酵母双杂交系统
• 1.3.2 分子荧光互补技术
• 1.3.3 免疫共沉淀
• 1.4 与植物表皮毛发育相关的转录因子的研究进展
• 1.4.1 MYB类转录因子
• 1.4.2 含WD40重复序列的转录因子
• 1.4.3 bHLH类转录因子
• 1.4.4 含HD-ZIP的转录因子
• 1.4.5 WRKY类转录因子
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒、载体和感受态细胞
• 2.3 基因序列分析
• 2.4 载体的构建
• 2.4.1 超量表达载体的构建
• 2.4.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 2.4.3 酵母双杂交载体的构建
• 2.4.4 双分子荧光互补载体的构建
• 2.5 烟草遗传转化及转基因烟草的获得
• 2.6 DNA的抽提与PCR阳性检测
• 2.6.1 烟草叶片DNA小量法抽提
• 2.6.2 转基因烟草PCR阳性检测
• 2.7 RNA的抽提和反转录
• 2.8 RT-PCR和实时定量RT-PCR的检测
• 2.9 石蜡切片
• 2.10 电镜扫描
• 2.11 类黄酮类物质的提取与测定
• 2.11.1 花青素的提取和测定
• 2.11.2 黄酮醇的提取和测定
• 2.12 转基因烟草叶片表皮毛及根毛数量的观察与测定
• 2.13 酵母双杂交
• 2.14 双分子荧光互补实验（BiFC）
• 3 结果与分析
• 3.1 候选基因片段的获得
• 3.2 遗传转化材料的获得
• 3.2.1 超量表达转化载体的构建
• 3.2.2 抑制表达转化载体的构建
• 3.2.3 农杆菌介导的转化
• 0代转基因植株的阳性检测'>3.2.4 T₀代转基因植株的阳性检测
• 3.3 AtCPC基因在烟草中的功能研究
• 3.3.1 AtCPC超量表达转基因烟草花朵颜色部分或全部缺失
• 3.3.2 AtCPC RNAi二次转化转基因烟草花朵颜色全部或部分回复
• 3.3.3 AtCPC超量表达转基因烟草叶片表皮毛及根毛的分布密度发生变化
• 3.3.4 AtCPC超量表达转基因烟草花瓣表皮细胞部分发育异常
• 3.3.5 AtCPC超量表达转基因烟草花瓣中花青素的含量降低
• 3.3.6 AtCPC转基因烟草花色的表型与AtCPC基因的表达水平密切相关
• 3.3.7 AtCPC超量表达转基因烟草中类黄酮合成路径中下游的基因表达量降低
• 3.3.8 AtCPC蛋白与已知的花青素合成调控因子有相互作用
• 4 讨论
• 4.1 AtCPC在烟草花青素合成中的功能
• 4.2 AtCPC对烟草表皮毛发育的影响
• 4.3 关于AtCPC等MYB基因在观赏植物分子育种应用上的思考
• 4.4 关于后续工作的设想
• 参考文献
• 附录A 部分实验的操作流程
• 附录B
• 致谢