论文摘要
背景与目的结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率有逐年增高的趋势。放化疗是当前治疗肿瘤的重要方法,而肿瘤细胞对放化疗的耐受性是临床上的普遍现象,也是影响放化疗疗效和预后的重要障碍,所以探索其主要机制以寻求逆转耐药的新的治疗策略对于提高临床治疗疗效具有重要意义。近年来,人们对于肿瘤治疗中耐受性进行了大量研究,主要集中在多药耐受性（multidrug resistance,MDR）。然而针对其耐药机制所设计的治疗方法,尽管在体外研究中效果显著,但临床上还没有得到抑制肿瘤细胞耐受性的理想效果（特别是实体瘤）。究其原因,既往对肿瘤耐药的研究多采用单层培养模型,而体内药物的作用标靶通常是具有一定组织结构的实体瘤,用单层细胞实验得到的结果常常不能反应体内肿瘤的情况,二者的状态存在显著差异。要想克服其耐药,不仅要阐明个体肿瘤细胞的耐药特性,更要考虑到细胞间的相互作用和相互协作,要重视肿瘤的“多细胞耐（药）受性（Multicellul resistance,MCR）”或“群集耐（药）受性”。有学者认为细胞间粘附是体内实体瘤群集耐药的重要结构基础,抗黏附治疗对肿瘤多细胞耐药有逆转作用,去除细胞黏附则多细胞耐药的性质很快消失。黏着斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）是介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间信号转导的重要的胞内分子,具有调节细胞与细胞外基质（ECM）粘附的作用。FAK通过多种信号通路在细胞粘附和抑制凋亡等多方面发挥了重要作用,这些都影响到化疗的敏感性。FAK可能是介导肿瘤多细胞耐药的主导因素或关键因子之一;又由于FAK在结肠癌中高表达,而正常结肠壁中不表达或为弱阳性。因而,FAK具有调节细胞黏附和对抗凋亡作用,并作为多条信号通路的上游分子可能是结直肠治疗的一个重要靶点,探讨FAK与结直肠癌多细胞耐药的关系可能在逆转临床肿瘤耐药方面取得很大的进展,成为克服结直肠癌新的靶向治疗策略。RNAi具有高效、特异的靶向作用与沉默机制,其对靶基因的抑制效果优于反核苷酸技术。多细胞球（multicellular spheroids,MCSs）是很好的能模拟体内实体瘤细胞特性的模型,与单层细胞相比,MCSs更接近体内肿瘤的情况。因此本课题拟采用三维多细胞球培养模型,通过RNA干扰抑制FAK的表达,先通过体外实验研究其对多细胞球药物5-FU敏感性的影响,进而通过体内实验研究其对裸鼠移植瘤药物5-FU敏感性的影响,并初步探讨分子机制。研究方法1.应用免疫组化及Western blotting检测FAK在四种结肠癌细胞株中的表达,并检测结直肠癌组织标本中FAK、磷酸化FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2等凋亡通路相关蛋白的表达情况,分析与临床病理学参数的关系,以及与FAK表达的相关性。2.构建FAK RNAi载体,对体外培养结肠癌HT-29细胞进行转染,筛选相应稳定表达克隆,干扰HT-29细胞中FAK表达,并采用免疫组化、RT-PCR、Real-time PCR、Western blotting等方法鉴定FAK的被抑制情况。3.将干扰前后的细胞进行三维多细胞球体培养,采用血球记数法检测抑制FAK表达对多细胞球的增殖的影响,通过MTT法和CCK-8试剂盒检测抑制FAK表达对多细胞球5-FU敏感性的影响,并应用流式细胞术检测抑制FAK表达对多细胞球的药物5-FU诱导凋亡的影响。4.采用Western blotting检测干扰前后多细胞球体中与FAK介导生存信号通路相关的凋亡蛋白磷酸化FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2等的水平,初步探讨抑制FAK表达增加结肠癌多细胞球对5-FU的敏感性的分子机制。5.采用培养细胞皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型,观测FAK干扰对裸鼠移植瘤生长的抑制作用。6.应用Western blotting检测不同组裸鼠移植瘤中FAK、磷酸化FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2等抗凋亡通路相关蛋白的表达情况,初步探讨抑制FAK表达对裸鼠移植瘤生长抑制的分子机制。结果1.四种结肠癌细胞株LoVo、HCT116、HT-29、SW480内都能检测到FAK蛋白,其中HT-29细胞中的FAK表达最高。结肠癌组织标本中FAK、FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2的阳性率分别为82.43%、45.95%、52.70%、59.46%、48.65%、70.27%,与正常结肠壁组织组相比差异有统计学意义（P <0.05）。FAK的表达不受患者性别、年龄、肿瘤的大小及位置、临床Dukes’分期的影响（ P >0.05）,但与分化程度、淋巴结转移有关（P <0.05）。AKT表达阳性率在分化程度低的组织中明显高于分化程度高的组织（P <0.05）,NF-κB表达阳性率与淋巴结转移有关（P <0.05）。在与FAK相关性分析中,FAKpY397、Caspase-3、Bcl-2表达与FAK表达无显著相关（P >0.05）,但AKT、NF-κB表达与FAK表达有显著正相关性（P <0.05）。2.成功构建了靶向FAK的RNAi载体,并转染HT-29细胞,免疫组化、RT-PCR、Real-time PCR、Western blotting方法检测FAK靶向RNAi后FAK的表达均明显降低,FAK的mRNA和蛋白表达的抑制率分别约为79.2%%±2.97%和79.9%±5.44%,与未转染组相比均具有差异显著（ P <0.05）,而转染阴性对照载体组与未转染组间表达无差异显著（P >0.05）。3.多细胞球增殖结果:各组细胞倍增时间均约为6天,与未转染组相比,转染阴性对照载体组、转染pGenesil-1-FAK组的多细胞球各时间点的生长增殖速度均分别无显著性差别（P >0.05）。MTT检测结果:与未转染组IC50值相比,转染阴性对照载体组与其无显著性差异（P >0.05）;而在转染pGenesil-1-FAK组的IC50值显著下降（P <0.01）。CCK-8检测结果与MTT基本一致。采用流式细胞术检测FAK干扰对多细胞球诱导凋亡的影响,结果显示:与未转染组的凋亡率（8.87%±0.57%）相比,转染阴性对照载体组多细胞球的诱导凋亡率（8.99%±0.55%）与之无明显差异（P >0.05）,而转染pGenesil-1-FAK组的多细胞球的诱导凋亡率（21.50%±4.62%）和未经药物诱导的凋亡率（16.48%±1.18%）均显著增加（ P <0.01）,且其诱导凋亡率显著高于非药物诱导凋亡率（P <0.01）。4.采用Western blotting检测干扰前后多细胞球体中与FAK、FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2等的表达水平。结果显示:与未转染组相比,转染阴性对照载体组MCSs中FAK、FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2的表达与之均无明显改变;而转染pGenesil-1-FAK组MCSs中的FAK、FAK pY397、AKT、NF-κB、Bcl-2表达均降低,促凋亡分子Caspase-3的表达升高。5.通过抑瘤效应观察,结果显示:A组、B组的移植瘤进行性增大明显,瘤体较重,瘤重分别为4.204±0.658g和4.013±0.540g,两组间瘤重无显著性差异（P >0.05）;而C组、D组、E组的移植瘤稍缓慢,瘤体中等,瘤重分别为2.427±0.394g、2.833±0.331g、2.741±0.251g,三组间瘤重无显著性差异（P >0.05）;F组移植瘤生长尤其缓慢,瘤重最轻,较用化疗药的D组、E组均有显著性差异（P <0.05）,且F组的移植瘤的抑瘤率达73.72%,与其他5组比较差异均有显著性意义（P <0.05）。6.采用Western blotting检测裸鼠移植瘤中FAK、FAK pY397、AKT、NF-κB、Caspase-3、Bcl-2等的表达水平。结果显示:与未转染组（A组）相比,B组、D组和E组中上述所有凋亡相关蛋白的表达均分别无明显差别;而在接种转染pGenesil-1-FAK细胞即C组、F组的组织中,FAK、FAK pY397、NF-κB、AKT、Bcl-2蛋白表达较其它组低,而Caspase-3表达较其它组高,C组、F组之间蛋白表达没有大的差异。结论1.四种结肠癌细胞株中HT-29的FAK蛋白表达最高。结直肠癌组织中,FAK、AKT、NF-κB均高表达,Caspase-3低表达,且AKT、NF-κB表达与FAK有显著正相关性,暗示其在结直肠癌的演进中起了重要作用。2. FAK的RNAi载体构建并稳定转染成功,有效地抑制了FAK的mRNA和蛋白表达。3.抑制FAK的表达不影响多细胞球的增殖,但能促进多细胞球的凋亡,并能显著促进其对5-FU诱导凋亡,增强其对化疗药物5-FU的敏感性。4.抑制FAK表达能很好的抑制裸鼠移植瘤的生长,增加瘤体对化疗药物5-FU的敏感性,从而有效地逆转其多细胞耐药。5.抑制FAK的表达能下调Akt、NF-κB的表达水平,从而促进细胞凋亡,增加其对化疗药物的敏感性,从而有效地逆转多细胞耐药。6.信号通路FAK- Akt-NF-κB是FAK介导多细胞耐药的机制之一。