论文摘要
近年来，兽药残留的危害已成为一个世界范围内被高度关注的问题，因此，药残检测方法的建立也就成了研究的热点。但是现有的检测方法多数存在着价格昂贵、操作繁琐、灵敏度不高等问题。本研究以人工灌服小鼠喹乙醇为模型，利用差异显示反转录PCR（DDRT-PCR）技术寻找在灌服前后小鼠不同组织中差异表达的基因，试图建立喹乙醇残留与基因表达之间的特异性关系，为建立分子生物学检测手段奠定基础。首先提取健康昆明白雌性小鼠的肝脏、肾脏、卵巢，雄性小鼠睾丸总RNA，利用设计合成的3’端锚定引物进行反转录合成cDNA第1链，然后再利用5’端随机引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序胶SDS-PAGE，确定各项技术参数，建立DDRT-PCR检测技术。选取昆明白小鼠60只，雌雄各半，在普通条件下饲养。将雌性和雄性鼠分别随机分为2组，共4组。将雌鼠和雄鼠各取1组为实验组进行灌服25mg／ml喹乙醇，每只35μl，另一组为对照组，灌胃同样剂量的水，每天1次，连续灌服5天。同时取实验组和对照组雌小鼠的肝、肾、卵巢，雄小鼠的睾丸，利用上述已建立的DDRT-PCR检测技术寻找不同组织中差异表达的基因。分别在肝中发现8条差异基因，在肾中发现4条，在卵巢中发现1条，在睾丸中发现2条，共发现15条差异基因。对这些基因进行二次PCR扩增后进行序列测定，并与GenBank中小鼠的基因组基因或cDNA进行比对，结果发现在肾中差异表达的基因有3条为cDNA，分别命名为F1、F2、F3。根据F1、F2、F3的序列测定结果设计特异性引物，对实验组和对照组小鼠的肾脏总RNA进行特异性RT-PCR扩增，结果表明，这三条基因在实验组中的表达水平明显高于对照组。对F1、F2、F3进行功能性分析，发现F1与蛋白磷酸酶1B基因同源性为100％。蛋白磷酸酶是一大类控制人体蛋白质去磷酸化的关键酶，在信号转导途径中起关键调节作用；F2与CCCH锌指型结构包含3个半胱氨酸、8个组氨酸（zc3h8）同源性为99％，锌指是一种常出现在DNA结合蛋白中的一种结构基元，具有锌指结构的蛋白大多都是与基因表达的调控有关的功能蛋白；F3与Nudix基因同源性为98％，Nudix属于核苷二磷酸盐水解酶家族，具有磷酸水解酶的活性，存在于抵抗诱导有机体突变的物质中。从本实验得到的初步结果可以看出，喹乙醇可以引起小鼠肾脏内某些基因表达的改变。如能够确定这些差异表达的基因与喹乙醇之间的特异性关系，将为建立分子生物学检测方法奠定坚实的基础，同时为分子药理学研究提供新的科学手段。