超量表达酵母腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因（ySAMDC）对番茄耐热性的影响

论文摘要

多胺广泛存在于所有生物中，并且在植物的生长发育过程中起重要的作用。S-腺苷甲硫胺酸脱羧酶（SAMDC）是多胺合成途径中的一个关键调节酶基因。SAMDC催化腺苷甲硫氨酸（SAM、AdoMet）形成脱羧的SAM，它为多胺生物合成提供氨丙基供体。因此研究SAMDC的分子特征及调节作用对于探索多胺的生物学功能具有十分重要的意义。番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界上生产面积与总产量最高的蔬菜作物，同时也是我国南北各地广泛栽培的夏秋季主要蔬菜。高温是番茄生产重要的限制因子之一，高温易使番茄授粉受精失败，导致落花落果，同时可导致果实品质变劣。因此对番茄耐热性的研究具有重要的现实意义。本研究以通过农杆菌介导法获得的SAMDC基因转化植株为材料，经过分子验证、遗传分析以及园艺学性状观察后，研究转基因材料在高温处理时光合作用、抗氧化酶系统以及内源多胺含量的变化，旨在探讨SAMDC基因超量表达对番茄耐热性的影响，为阐明多胺对番茄耐热性的调控作用提供研究基础。主要研究结果如下：（1）对已获得的46株HygR转基因T0代番茄植株进行了PCR检测，结果有35株含1100 bp ySAMDC基因扩增产物，阳性率为76.1％；对11株PCR检测为阳性的转化植株进行Southern杂交检测，有9株有杂交信号，阳性率为81.8％，表明外源基因成功整合到了这9株转基因植株的基因组中；对9株转化植株的果实进行Northern杂交检测SAMDC基因在各个植株中的表达情况，有7株有表达信号。（2）对T1代的5个株系35S-b2、35S-b5、35S-b6、E8-A7、E8-M2和对照株系进行PCR检测，发现株系35S-b6、E8-A7、E8-M2呈阳性，PCR检测这3个株系的单株，分离比列分别为：8：1、7：3、5：1，不完全符合孟德尔遗传分离规律。（3）以T0代7个转化株系（芽系）和对照植株的果实为材料来分析SAMDC基因对番茄果实性状的影响。实验发现，仅转化株系35S-b2的果实横径和单果均重以及E8-M2的果实纵径低于对照果实，其它均高于对照；转化株系的果实硬度、糖度、Vc含量相比对照都有相应的提高；转化株系的番茄红素含量相比对照有显著增加，其中株系35S-b2，35S-b5，35S-b6，E8-Q4，E8-A7均增加了1倍以上。（4）对T1代的5个转基因株系和对照株系进行高温处理，通过分析番茄叶片光合作用参数和光合色素、抗氧化酶系统、耐热性鉴定指标及多胺含量的变化来揭示转入番茄中的SAMDC基因是否能够提高其耐热性。高温胁迫前后，转化株系的叶片净光合速率、Fv／Fm和叶片相对电导率的变化幅度高于对照株系，而蒸腾速率和气孔导度又是对照株系的变化幅度大于转化株系；叶片光合色素含量、抗氧化酶系统以及游离脯氨酸、谷胱甘肽和多胺含量的变化幅度有的高于对照株系，有的低于对照株系，株系间没有一致的变化规律。因而超量表达SAMDC基因对番茄植株苗期耐热性的影响在T1代不同株系中表现不同，需要在高代纯系中进行验证。

论文目录

• 目录
• 缩写词（Abbreviation）
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1. 文献综述
• 1.1 番茄耐热性研究进展
• 1.1.1 高温对番茄主要生理生化过程的影响
• 1.1.2 番茄耐热品种选育
• 1.1.3 番茄耐热性遗传
• 1.1.4 番茄耐热性鉴定方法和技术
• 1.1.4.1 田间自然鉴定法
• 1.1.4.2 人工模拟直接鉴定法
• 1.1.4.3 微观结构指标鉴定
• 1.1.4.4 生理生化指标鉴定
• 1.1.4.5 分子生物学指标
• 1.2 植物多胺与逆境胁迫的关系
• 1.2.1 多胺生物合成与分解代谢途径
• 1.2.2 多胺对逆境的应激反应
• 1.2.3 逆境下多胺生物合成酶基因的克隆与表达
• 1.2.4 多胺代谢酶基因转录调控对植物抗逆性的影响
• 1.3 SAMDC研究进展
• 1.3.1 植物中己分离得到的SAMDC基因
• 1.3.2 SAMDC基因的表达调控
• 1.3.3 SAMDC的生物学功能
• 2. 转化植株的分子检测与遗传分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料与试剂
• 2.1.2 植物基因组DNA和总RNA的提取
• 2.1.2.1 CTAB法提取番茄总DNA
• 2.1.2.2 番茄总RNA的提取及检测
• 2.1.3 转化植株的PCR检测
• 2.1.4 转化植株的X-Gluc组织化学染色检测
• 2.1.4.1 GUS染色液的配制
• 2.1.4.2 GUS染色方法
• 2.1.5 转化植株的RT-PCR检测
• 2.1.5.1 cDNA的合成
• 2.1.5.2 转化植株的RT-PCR检测
• 2.1.6 转化植株的Southern印迹杂交和Northern印迹杂交检测
• 2.1.6.1 Southern印迹杂交检测
• 2.1.6.2 Nouthern印迹杂交检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 植物基因组DNA和总RNA的提取
• 2.2.2 转化植株的PCR检测
• 2.2.3 转化植株的X-Gluc组织化学染色检测
• 2.2.4 转化植株的RT-PCR检测
• 2.2.5 转化植株的Southern印迹杂交和Northern印迹杂交检测
• 2.2.5.1 Southern印迹杂交检测
• 2.2.5.2 Northern印迹杂交检测
• 1代转化株系番茄基因组DNA的提取和PCR检测'>2.2.6 T₁代转化株系番茄基因组DNA的提取和PCR检测
• 1代转化株系单株的PCR检测'>2.2.7 T₁代转化株系单株的PCR检测
• 2.3 讨论
• 3. 转化番茄果实形态学观察及生理指标分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料与试剂
• 3.1.2 转化番茄果实形态观察
• 3.1.3 果实硬度测定
• 3.1.4 果实糖度测定
• 3.1.5 果实Vc含量测定
• 3.1.6 果实番茄红素含量测定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 果实形态的变化
• 3.2.2 果实硬度
• 3.2.3 果实糖度
• 3.2.4 果实Vc含量
• 3.2.5 果实番茄红素含量
• 3.3 讨论
• 1代转化植株的耐热性分析'>4. T₁代转化植株的耐热性分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 光合和荧光参数的测定
• 4.1.3 叶片光合色素含量的测定方法
• 4.1.4 抗氧化酶活性的测定
• 4.1.4.1 过氧化氢酶活性测定方法
• 4.1.4.2 抗坏血酸过氧化物酶测定方法
• 4.1.4.3 愈创木酚过氧化物酶测定方法
• 4.1.4.4 超氧歧化酶活性测定方法
• 4.1.5 丙二醛的测定方法
• 4.1.6 可溶性蛋白含量测定方法
• 4.1.7 叶片相对电导率测定方法
• 4.1.8 游离脯氨酸含量测定方法
• 4.1.9 荧光法测定还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽
• 4.1.10 多胺提取和测定方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 高温处理对番茄幼苗光合参数的影响
• 4.2.2 高温处理对番茄叶绿素荧光参数的影响
• 4.2.3 高温处理对番茄幼苗叶片光合色素含量的影响
• 4.2.4 高温处理对番茄幼苗抗氧化酶活性的影响
• 4.2.5 对丙二醛含量的影响
• 4.2.6 对可溶性蛋白含量的影响
• 4.2.7 高温处理对番茄幼苗叶片相对电导率的影响
• 4.2.8 高温处理对番茄幼苗游离脯氨酸含量的影响
• 4.2.9 高温处理对番茄幼苗还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽含量的影响
• 4.2.10 高温处理对番茄幼苗多胺含量的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 高温胁迫对番茄光合作用及光合色素的影响
• 4.3.2 高温胁迫对番茄抗氧化酶系统的影响
• 4.3.3 高温胁迫对番茄耐热性影响
• 4.3.4 高温胁迫对番茄多胺合成的影响
• 4.3.5 超量表达SAMDC基因对番茄耐热性的影响
• 结论
• 参考文献
• 附图