大黄总蒽醌对结肠和肾脏水通道蛋白表达的调节效应

大黄总蒽醌对结肠和肾脏水通道蛋白表达的调节效应

论文摘要

大黄是传统的泻下药物,广泛应用于临床各科。大黄不仅具有“泻下”作用,还具有明显的“利尿”效应。大黄的泻下、利尿效应可能与其对结肠和肾脏水代谢的调节密切相关。抑制结肠水分吸收,可产生“泻下”效应;抑制肾脏对水分的重吸收,引起“利尿”效应。近年来研究发现,与体内水分吸收、排泄、分泌关系密切的是一种分布广泛的位于细胞膜上的蛋白,即水通道蛋白(aquaporins, AQPs)。大黄的泻下、利尿效应是否与其对结肠、肾脏的AQPs表达的调节有关,AQPs是否是大黄产生泻下、利尿效应的作用靶点,国内外未见报道。此外,长期应用大黄蒽醌类泻剂可引起机体对泻剂的耐受,随着剂量的加大,泻下效应越来越差,可导致结肠神经和肌肉的损伤,结肠动力障碍,形成“泻剂结肠”,甚至结肠黑变病。我们推测在病变过程中可能也存在水通道蛋白表达的改变。临床有关于中药“增液汤”对结肠黑变病的治疗的报道,但尚无相关实验性研究。如果“增液汤”能够治疗泻剂结肠,那么将会对防治大黄的副作用以及其更合理的应用提供可靠的理论支持。本研究通过给予SD大鼠不同剂量的大黄总蒽醌灌胃,观察尿量、粪便含水量以及血液、尿液生化指标,以及应用免疫组化、western blot和RT-PCR检测结肠和肾脏AQP2、AQP4表达的变化,来探讨大黄总蒽醌的泻下、利尿效应与AQP2、AQP4表达的关系。通过复制大鼠“泻剂结肠”模型,观察造模不同时期结肠AQP2、AQP4表达的变化。此外,给予模型组大鼠增液汤灌胃,进行干预性治疗,观察增液汤对结肠肠道病理变化的影响及此时AQP2、AQP4表达的变化。这将为大黄药理作用机制的研究,以及其副作用防治提供可靠的实验性依据。实验一大黄总蒽醌对大鼠结肠AQP2、AQP4表达的调节效应目的:探讨大黄总蒽醌对结肠AQP2及AQP4表达的调节与其泻下效应的关系。方法:提取大黄总蒽醌,32只SD大鼠随机分为正常对照组,大黄总蒽醌低剂量组、泻下剂量组和高剂量组,分别给予各组不同剂量的大黄总蒽醌给灌胃。5 d后检测全段结肠粪便含水量,并留取结肠,运用western blot及RT-PCR检测结肠AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达。结果:大黄总蒽醌低剂量组大鼠无泻下现象,粪便含水量及结肠AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达无显著差异;泻下剂量组大鼠出现软便及稀便,AQP2蛋白及mRNA表达降低(P<0.05),但AQP4 mRNA表达上调,AQP4蛋白表达降低(P<0.05)2、AQP4蛋白及mRNA表达亦显著降低(P<0.01)。实验二大黄总蒽醌对大鼠肾脏AQP2、AQP4表达的调节效应目的:探讨大黄总蒽醌对大鼠肾脏AQP2、AQP4的调节与其利尿效应的关系。方法:32只SD大鼠随机分为正常对照组,大黄总蒽醌低、中、高剂量组,分别给予不同剂量大黄总蒽醌灌胃,测定大鼠24 h尿量,尿液Na+浓度及尿渗透压;5 d后处死,腹主动脉取血,进行血液生化指标检测;并留取肾脏,运用免疫组化、western blot和RT-PCR法检测肾脏AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达变化。结果:大黄总蒽醌中、高剂量组大鼠24 h尿量明显增加(P<0.05),低剂量组大鼠尿量变化不明显;中、高组大鼠肾脏AQP2蛋白及mRNA表达均明显下降(P<0.01),高剂量组大鼠肾脏AQP4蛋白及mRNA表达明显下降(P<0.01);中剂量组大鼠AQP4蛋白表达下降(P<0.01),mRNA表达有所增加,但差异无统计学意义;低剂量组大鼠AQP2、AQP4蛋白及mRNA表达变化不明显,差异无统计学意义。实验三增液汤对大鼠“泻剂结肠”治疗机制的研究目的:探讨增液汤对大鼠“泻剂结肠”治疗的可能机制。方法:第一期大鼠泻剂结肠模型的建立,50只大鼠随机分为正常组12只、模型组38只,造模成功后,对模型组大鼠进行鉴定,分别采用活性炭推进法检测肠道的推进功能、PGP9.5免疫组织化学染色法观察肌间神经元数量的变化和HE染色观察肠道病理改变。第二期增液汤对大鼠泻剂结肠的治疗作用;第一期造模成功剩余的12只大鼠,随机分为模型对照组和模型治疗组各6只,模型治疗组加灌增液汤,30 d后处死,测定肠道推进功能,观察肌间神经元数量的变化和肠道病理。结果:模型组大鼠出现肠道推进功能明显减弱(P<0.01)、肌间神经元数目减少(P<0.05)以及黏膜下炎症细胞浸润;模型治疗组加灌增液汤30 d后,各项指标均有明显改善。实验四泻剂结肠大鼠结肠AQP2、AQP4表达的变化的研究目的:观察大鼠泻剂结肠造模不同时期AQP2、AQP4表达的变化,进一步探讨泻剂结肠的形成机制。方法:大鼠泻剂结肠模型的建立与实验三相同,50只大鼠随机分为正常组12只、模型组38只,分别在不同时期选取正常组、第一次泻下、第二次泻下、第三次泻下、模型组及治疗组,各6只处死,留取结肠,采用免疫组化、RT-PCR、western blot检测AQP2、AQP4表达的变化。结果:第二次泻下、第三次泻下、模型组及模型治疗组大鼠结肠AQP2、AQP4表达均明显降低(P<0.01),第一次泻下组AQP2表达降低(P<0.01)。结论1.大黄总蒽醌对结肠AQP2和AQP4的表达的抑制作用,可能是其产生泻下效应的新机制之一。2.大黄总蒽醌对肾脏AQP2、AQP4的表达的抑制作用,可能是其产生利尿作用的分子机制之一。3.大黄总蒽醌对结肠和肾脏AQP2、AQP4的表达具有同步调节效应,这可能是其产生多重功效的机制之一。4.增液汤能有效改善泻剂结肠模型大鼠的肠道传输功能、保护肌间神经丛神经元,这可能是其对泻剂结肠具有治疗作用的原因之一。5.泻剂结肠形成过程中存在结肠AQP2、AQP4mRNA表达的抑制;经过增液汤的干预性治疗,AQP2、AQP4的表达改变不明显。泻剂结肠的的形成是否与水通道蛋白表达的变化有关,还有待进一步研究。

论文目录

  • 缩略语表
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 文献回顾
  • 正文
  • 实验一 大黄总蒽醌对大鼠结肠AQP2、AQP4 表达的调节效应
  • 引言
  • 1 材料
  • 1.1 药材
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 2 方法
  • 2.1 动物分组与给药
  • 2.2 标本采集及粪便含水量测定
  • 2.3 结肠AQP2、AQP4 表达的免疫组化检测
  • 2.4 结肠AQP2、AQP4 mRNA表达的RT-PCR检测
  • 2.5 结肠AQP2、AQP4 蛋白表达的western blot检测
  • 2.6 统计学方法
  • 3 结果
  • 3.1 一般情况观察
  • 3.2 大黄总蒽醌对粪便含水量的影响
  • 3.3 结肠AQP2、AQP4 表达的免疫组化结果
  • 3.4 结肠AQP2、AQP4mRNA表达的RT-PCR检测结果
  • 3.5 结肠AQP2、AQP4 蛋白表达的western blot检测结果
  • 4 讨论
  • 实验二 大黄总蒽醌对大鼠肾脏AQP2、AQP4 表达的调节效应
  • 引言
  • 1 材料
  • 1.1 药材
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 2 方法
  • 2.1 动物分组与给药
  • 2.2 标本采集及相关指标检测
  • 2.3 肾脏AQP2、AQP4 表达的免疫组织化学检测
  • 2.4 肾脏AQP2、AQP4 mRNA表达的RT-PCR检测
  • 2.5 肾脏AQP2、AQP4 蛋白表达的western blot检测
  • 2.6 统计学方法
  • 3 结果
  • 3.1 大鼠一般情况及尿、血指标
  • 3.2 肾脏AQP2、AQP4 表达的免疫组化结果
  • 3.3 肾脏AQP2、AQP4mRNA表达的RT-PCR检测结果
  • 3.4 肾脏AQP2、AQP4 表达的western blot检测结果
  • 4 讨论
  • 实验三 增液汤对大鼠“泻剂结肠”治疗机制的研究
  • 引言
  • 1 材料
  • 1.1 药材
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 2 方法
  • 2.1 泻剂结肠模型的建立
  • 2.2 泻剂结肠模型的治疗
  • 2.3 大鼠泻剂结肠模型的鉴定
  • 2.4 统计学方法
  • 3 结果
  • 3.1 一般情况观察
  • 3.2 肠道传输功能的变化
  • 3.3 结肠肌间神经丛神经元数目的变化
  • 3.4 肠道HE染色观察
  • 4 讨论
  • 实验四 泻剂结肠大鼠结肠AQP2、AQP4 表达的研究
  • 引言
  • 1 材料
  • 1.1 药材
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 主要试剂
  • 2 方法
  • 2.1 标本采集及相关指标检测
  • 2.2 结肠AQP2、AQP4 表达的免疫组织化学检测
  • 2.3 结肠AQP2、AQP4 mRNA表达的RT-PCR检测
  • 2.4 统计学方法
  • 3 结果
  • 3.1 大鼠一般情况观察
  • 3.2 结肠AQP2、AQP4 表达的检测结果
  • 4 讨论
  • 小结
  • 参考文献
  • 附录
  • 附录一 唐古特大黄及大黄总蒽醌鉴定附件
  • 附录二 实验附图
  • 个人简历和研究成果
  • 致谢
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