蓖麻毒素的原核表达研究和抗虫植物表达载体P-En的构建

论文摘要

虫害严重影响农业生产,影响作物的产量和品质,制约农业经济的稳定发展。长期以来人们普遍采用化学杀虫剂来控制害虫,但是随着时间的推移,化学杀虫剂的弊端逐渐暴露。利用植物抗虫基因工程培育的抗虫作物,可以避免害虫危害,还具有成本低、保护全、特异性强等优点,从而倍受关注,成为当前农业生物工程研究的一个热点。目前人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因,有许多抗虫转基因植物正在进行田间试验,还有一些品种已商品化,并在生产上表现出了良好的应用前景。但是由于转基因植物在应用中也存在一些潜在的问题,所以需要开发一些新型、高效的抗虫基因来解决这些问题。本研究既是在此背景下进行的。主要研究结果为:（1）利用蓖麻全基因组为模板,扩增了蓖麻毒素基因,构建了克隆载体,原核表达载体。重组质粒转化大肠杆菌BL21后,经IPTG诱导,表达出了目的蛋白。蛋白质电泳表明目的蛋白以包涵体形式表达。（2）克隆并表达了蓖麻毒素B链蛋白,通过Western Blot,纯化等方法进一步鉴定了该蛋白。为进一步验证该蛋白的功能奠定了基础。（3）成功构建了粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白（TnGV-En）基因的植物表达载体P-En,其中En基因位于CaMV35s启动子下游,酶切鉴定表明,目的基因已正确插入该载体中。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1. 文献综述
• 1.1 抗虫基因种类
• 1.1.1 微生物来源的抗虫基因
• 1.1.1.1 Bt 基因
• 1.1.1.2 增效蛋白
• 1.1.2 动物来源的抗虫基因
• 1.1.3 植物来源的抗虫基因
• 1.1.3.1 蛋白酶抑制剂类抗虫基因
• 1.1.3.2 淀粉酶抑制剂
• 1.1.3.3 植物凝集素
• 1.1.3.4 核糖体失活蛋白
• 1.2 蓖麻毒素（Ricin Toxin RT）的研究概况
• 1.2.1 蓖麻毒素的研究历史
• 1.2.2 蓖麻毒素的结构
• 1.2.3 蓖麻毒素的毒性和作用机制
• 1.2.4 蓖麻毒素与生物杀虫剂
• 2. 引言
• 3. 材料与方法
• 3.1 材料、试剂与仪器
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 蓖麻总基因组的提取
• 3.2.2 RT 和RTB 的分子克隆
• 3.2.2.1 基因特异引物序列的设计
• 3.2.2.2 目的基因的扩增
• 3.2.2.3 切胶回收目的基因片段
• 3.2.2.4 回收的目的基因片段与PMD-19 T Vector 的连接
• 3.2.2.5 连接产物对大肠杆菌的转化
• 3.2.2.6 碱裂解法提取重组质粒
• 3.2.2.7 重组质粒的PCR 鉴定
• 3.2.2.8 重组质粒的单双酶切验证
• 3.2.3 RT 和RTB 的原核表达及蛋白纯化
• 3.2.3.1 PET-28a 质粒的获得
• 3.2.3.2 PET-28a 质粒双酶切
• 3.2.3.3 RT-19T 和RTB-19T 的双酶切
• 3.2.3.4 目的基因插入PET-28a 质粒中
• 3.2.3.5 目的蛋白的诱导表达
• 3.2.3.6 SDS-PAGE 检测表达产物
• 3.2.3.7 目的基因的Western Blot
• 3.2.3.8 目的基因的纯化
• 3.2.4 植物表达载体P-En 的构建
• 3.2.4.1 En 基因引物的设计
• 3.2.4.2 En 基因的PCR
• 3.2.4.3 回收目的基因En 片段
• 3.2.4.4 回收的En 片段与pGEM-T 的连接
• 3.2.4.5 连接产物对大肠杆菌的转化
• 3.2.4.6 重组质粒的PCR 验证
• 3.2.4.7 重组质粒的双酶切验证
• 3.2.4.8 植物表达载体P-En 的构建
• 4. 结果与分析
• 4.1 RT 和RTB 基因的扩增
• 4.2 RT 和RTB 基因克隆载体的构建
• 4.3 RT 和RTB 基因原核表达载体的构建
• 4.4 目的蛋白的诱导表达结果及分析
• 4.4.1 RT 基因的原核表达
• 4.4.2 RTB 的原核表达
• 4.5 目的蛋白的Western Blot
• 4.5.1 RT 蛋白的Western Blot
• 4.5.2 RTB 的Western Blot
• 4.6 目的蛋白的纯化
• 4.6.1 RT 蛋白的纯化
• 4.6.2 RTB 蛋白的纯化
• 4.6.3 RTB 的复性、浓缩
• 4.7 植物表达载体P-En 的构建
• 4.7.1 En 的扩增
• 4.7.2 En 克隆载体的构建
• 4.7.3 En 基因植物表达载体的构建
• 5. 结论和讨论
• 参考文献
• 英文摘要