重组纤维连接蛋白C端及N端肝素结合域两种多肽的制备及其对小鼠败血症治疗作用的研究

论文摘要

败血症是临床常见的危重症,尽管大量高效抗生素的不断问世和日臻完善的器官支持和重症监护技术,其病死率仍较高。所以,人们一直在研究开发有效的治疗药物。纤维连接蛋白是一种多功能的糖蛋白,能与肝素、胶原、纤维蛋白以及整合素家族的细胞表面受体结合,参与细胞的黏附、迁移、止血、抗感染以及维持血管的完整性等作用。大量研究表明纤维连接蛋白FN具有抗败血症的作用,但从血浆分离FN存在着血浆资源浪费和可能传播血源性传染病的问题,同时由于FN分子量大,全分子表达又存在技术上的难题。因此利用基因工程技术表达FN的功能区多肽并研究其功能,以代替FN的抗败血症作用不失为一种可行的方法。本课题组前期成功地用大肠杆菌表达系统表达纯化了FN的细胞结合域多肽（rhFN55多肽）,用酵母表达系统表达纯化了FN N端肝素结合域多肽（FNNHBD）,实验表明这两种多肽具有治疗小鼠败血症的作用;本课题前期也应用基因工程方法构建了FN C端的肝素结合域多肽的酵母表达载体,并筛选出了高表达的酵母表达菌株,但在酵母表达系统中纯化FN C端的肝素结合域多肽（FNCHBD）并研究其对鼠败血症的作用,目前国内外还未见报道。本实验在前期研究的基础上,表达纯化FNCHBD和FNNHBD多肽,研究FNCHBD多肽对鼠败血症的作用以及比较FNCHBD和FNNHBD两多肽对鼠败血症的治疗效果。通过离心、超滤、过离子交换层析柱和分子筛层析柱对两多肽的酵母发酵上清进行纯化,通过Western-blot对纯化的多肽进行鉴定,并证实了两多肽都能够与FN的多克隆抗体结合,具有抗原性;将发酵上清通过过肝素亲和层析柱表明两多肽都能够挂柱,都具有肝素结合活性;经质谱分析测定FNCHBD的分子量为30.5KD,FNNHBD的分子量约为27.9KD。本研究按照A.-H. Kwon等用半乳糖胺（GalN）敏化LPS小鼠建立败血症模型,小鼠72小时的死亡率仅为60%,因此本研究在此基础上摸索了LPS的剂量,最后确定给每只小鼠腹腔注射LPS（100ug/kg）和GalN（400mg/kg）使小鼠的死亡率达到90%,建立了我们的败血症小鼠模型。通过观察72小时小鼠的存活率表明在LPS/GlaN注射半小时前给予FNCHBD和FNNHB两多肽都能提高模型小鼠的存活率,在生理盐水对照组中,小鼠的存活率为11.1%,而在FNCHBD和FNNHB两多肽的5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg这三个剂量组的存活率分别为33.3%、55.5%、66.7%和27.8%、50%、61.1%,都表现出剂量依赖效应。通过测定注射LPS/GalN注射后9小时血清中AST、ALT、LDH和TBIL的值,表明FNCHBD和FNNHB两多肽都能够降低血清中AST、ALT、LDH和TBIL的值,改善小鼠的肝功;通过用ELISA方法检测通过测定注射LPS/GalN注射后9小时小鼠血浆中的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平,表明FNCHBD和FNNHB两多肽都能够抑制血浆中上述炎症因子的表达;通过病理组织学观察,FNCHBD和FNNHB两多肽都能够减轻肝脏的损伤;通过电镜和TUNEL方法表明FNCHBD和FNNHB两多肽都能够抑制肝细胞的凋亡;并且实验结果表明FNCHBD和FNNHB两多肽的上述作用都呈现出剂量依赖效应。同时本研究发现在20mg/kg剂量的基础上,在注射LPS/GlaN后增加FNCHBD和FNNHB两多肽的给药次数对提高小鼠的存活率都没有意义,预防性地给予FNCHBD和FNNHB两多肽的治疗效果优于LPS/GlaN注射后给药。最后通过比较FNCHBD和FNNHBD两多肽对败血症小鼠的治疗效果,发现FNCHBD和FNNHBD治疗效果相近,无统计学上的差异。结论:本实验成功表达纯化出FNCHBD和FNNHBD多肽。成功建立了败血症小鼠模型,并表明了FNCHBD和FNNHBD肽都具有治疗鼠败血症的作用,且两者的治疗效果无统计学上的差异。治疗作用同样都具有剂量依赖性且作用机制相似,都是通过抑制TNF-α等炎症因子的产生,进而抑制肝细胞的凋亡,减轻肝脏的损伤。但在20mg/kg剂量的基础上,注射LPS/GlaN后增加给药次数都不能提高二者对鼠败血症的治疗效果,预防性地给予FNCHBD和FNNHB两多肽的治疗效果优于LPS/GlaN注射后给药。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 重组纤维连接蛋白 C 端及 N 端肝素结合域两种多肽的制备
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 FNCHBD 和FNNHBD 对败血症小鼠治疗作用的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢