表没食子儿茶素没食子酸酯水解酶的制备及应用

论文摘要

茶多酚是一类多酚化合物的统称,具有良好的生物活性,如抗氧化活性,抗肿瘤和抗突变性能。在生物体内作为活性氧自由基清除剂,能够降低癌症,冠心病和动脉硬化等疾病的发病率。绿茶中有五种主要茶多酚成分。由于不同结构的茶多酚单体具有不同的生理活性,因此为了更为有效地利用各种单体以及在单体的基础上研发新药,从而充分发挥各自的效用,提纯分离或合成茶多酚单体就显得尤为重要。由于化学法合成产率较低且副产物多,分离纯化困难,因此到目前为止,大多数的研究都是从茶提取物中分离纯化茶多酚单体。就表没食子儿茶素（EGC）而言,由于EGC在茶叶中的含量低,约占绿茶茶多酚总量的5%,即使提取分离的效率再高,产量仍然受到制约。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作为绿茶中茶多酚的主要成分,是EGC和没食子酸（GA）形成的酯。因此如能通过水解技术将EGCG水解成EGC和GA将具有十分重要的市场前景。当前,一些研究采用酸碱水解的常规化学方法处理EGCG,但水解率低,且EGCG和EGC在碱性条件下不稳定,极易被氧化。迄今为止,茶多酚生物转化方面的研究较少,已有研究存在转化率低、生产工艺复杂以及EGCG和EGC在转化条件下不稳定等缺点。所以建立一种将EGCG转化为EGC的稳定高效的生产方法变得格外重要和迫切。本研究建立了一种利用生物酶催化EGCG水解生产EGC的方法。本研究充分考虑到茶多酚单体在弱酸性条件下稳定的特性,先是选取了适于弱酸性条件下培养产酶的真菌;黑曲霉,米曲霉和里氏木霉作为产酶菌株,通过添加EGCG和橄榄油诱导产酶,期望诱导产生能够催化生产EGC的EGCG水解酶,从而得到最佳生产菌种。研究中利用薄层层析技术（TLC）和高效液相色谱技术（HPLC）对水解反应体系中产物和底物进行分析验证。筛选得到EGCG-水解酶的菌株米曲霉和黑曲霉,其二者通过培养基中添加EGCG诱导产生EGCG水解酶;而未添加任何诱导剂和添加橄榄油的发酵液没有EGCG水解酶活性;里氏木霉不具备产生EGCG水解酶的能力。此后,对黑曲霉和米曲霉两株产EGCG水解酶的菌株进一步研究,研究。EGCG的添加及用量对菌体生长代谢及产酶的影响,并建立酶活测定方法和酶催化水解反应体系等以确定最佳发酵产酶时间和得到最佳EGCG添加浓度,优化产酶条件。实验结果表明;随EGCG浓度的增加,各检测指标呈现明显的变化规律。EGCG浓度越高,pH值水平越低,残糖含量越高,菌体量越大;且各指标的最大值出现的时间也越迟;蛋白含量和水解酶活力的变化趋势,黑曲霉与米曲霉有所不同。综合体积酶活,比酶活和酶产率这几项指标对EGCG浓度的诱导效果进行评价,发现黑曲霉的最佳诱导剂浓度为2.5-7.5 mg/mL,而米曲霉则为10.0mg/mL,并且黑曲霉更易诱导。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 茶多酚的化学组成与结构
• 1.2 茶多酚的理化性质
• 1.3 茶多酚的抗氧化活性及作用机理
• 1.4 茶多酚的应用
• 1.4.1 茶多酚在食品工业中的应用
• 1.4.2 茶多酚在医药工业上的应用
• 1.4.3 茶多酚的保健美容作用
• 1.5 茶多酚在国内外的发展情况
• 1.6 茶多酚的生物转化研究进展
• 1.7 本课题研究的目的意义、主要内容及创新点
• 第2章 EGCG水解酶菌种的筛选
• 2.1 实验材料与仪器
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种培养及产酶
• 2.2.2 菌体干重测定
• 2.2.3 酶催化水解反应体系的构建
• 2.2.4 TLC分析
• 2.2.5 HPLC分析
• 2.2.6 粗酶性质初步研究
• 2.2.7 分光光度法测定酶活力
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 EGCG和橄榄油对菌体生长的影响
• 2.3.2 酶催化水解反应体系TLC分析
• 2.3.3 酶催化水解反应体系HPLC分析
• 2.3.4 EGCG浓度对诱导产酶活力的影响
• 2.3.5 水解酶性质初步研究
• 2.4 小结
• 第3章 黑曲霉和米曲霉产酶历程及酶解过程研究
• 3.1 实验材料及仪器
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 培养基
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 种子液制备
• 3.2.2 诱导产酶及取样
• 3.2.3 pH值测定
• 3.2.4 菌体干重测定
• 3.2.5 残糖含量测定
• 3.2.6 蛋白质含量测定
• 3.2.7 HPLC分析EGCG水解率和EGC生成率
• 3.2.8 水解酶酶活测定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 黑曲霉发酵pH值的变化
• 3.3.2 黑曲霉发酵残糖含量的变化
• 3.3.3 黑曲霉发酵总蛋白含量的变化
• 3.3.4 黑曲霉菌体干重的变化
• 3.3.5 黑曲霉水解酶活力的变化
• 3.3.6 米曲霉发酵pn值的变化
• 3.3.7 米曲霉发酵残糖含量的变化
• 3.3.8 米曲霉发酵总蛋白含量的变化
• 3.3.9 米曲霉菌体干重的变化
• 3.3.10 米曲霉水解酶活力的变化
• 3.4 小结
• 第4章 FGCG浓度对黑曲霉、米曲霉生长及产酶的影响
• 4.1 实验材料与仪器
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 种子液制备
• 4.2.2 诱导产酶
• 4.2.3 pH值测定
• 4.2.4 菌体干重测定
• 4.2.5 残糖含量测定
• 4.2.6 蛋白质含量测定
• 4.2.7 酶活测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 EGCG浓度对黑曲霉发酵液pH值的影响
• 4.3.2 EGCG浓度对黑曲霉发酵液残糖含量的影响
• 4.3.3 EGCG浓度对黑曲霉发酵液蛋白含量的影响
• 4.3.4 EGCG浓度对黑曲霉菌体干重的影响
• 4.3.5 EGCG浓度对黑曲霉产酶的影响
• 4.3.6 EGCG浓度对米曲霉发酵液pH值的影响
• 4.3.7 EGCG浓度对米曲霉发酵液残糖含量的影响
• 4.3.8 EGCG浓度对米曲霉发酵液蛋白含量的影响
• 4.3.9 EGCG浓度对米曲霉菌体干重的影响
• 4.3.10 EGCG浓度对米曲霉产酶的影响
• 4.3.11 黑曲霉与米曲霉产酶比较
• 4.4 小结
• 第5章 结论
• 5.1 EGCG水解酶菌种的筛选
• 5.2 黑曲霉和米曲霉产酶历程及酶解过程研究
• 5.3 EGCG浓度对黑曲霉、米曲霉生长及产酶的影响
• 5.4 展望
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果目录
• 致谢