柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究

论文摘要

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是世界性柑橘生产上的毁灭性病害。易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎叶病；病原分别为Citrus tristeza virus（CTV），Citrus exocortis viroid（CEVd），Citrus tatter leaf virus（CTLV）。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV为对象，从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究；目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系；在分子水平上明确其部分分子特性。另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及机理。主要获得结果如下： 1．HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化。以长春花和椪柑为指示植物，部分待检材料表现了明显HLB症状。通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整，建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测技术；并对三种方法的检测灵敏度进行比较，结果发现Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测灵敏度远高于常规PCR，是常规PCR的104倍。运用Nested-PCR技术在黄皮上检测出HLB病菌（Candidatus Liberobacter asiaticus），在国内外属于首次报道。 2．不同引物检测HLB病菌灵敏度比较。对基于rplA／rplK，β-operon，16SrDNA和16S／23SrDNA不同基因组序列设计的5对引物依次为fP400／rP400，fP535／rP535，fA2／rJ5，fOI1／rOI2c，fOI2／r23S1检测HLB病菌灵敏度进行了比较，结果发现不同引物检测灵敏度不一样，其检测灵敏度由高到低依次为：fP400／rP400＞fP535／rP535＞fA2／rJ5＞fOI1／rOI2c＞fOI2／r23S1。 3．HLB菌亚洲株系分子鉴定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-SSCP分析及基于16SrDNA序列中国柑橘黄龙病菌属分类地位的确立，分析结果显示来自中国7省区9个代表性的分离物16SrDNA高度保守，全部属于亚洲菌系（Candidatus Liberobacter asiaticus）。HLB病菌16S／23SrDNA间区序列分析及系统进化树分析结果显示：来自中国7省区分布在不同的寄主体内、导致寄主表现不同症状的18个分离物在该区段没有发生显著变异，各分离物之间的同源性达99％以上，全部与亚洲菌系（Candidatus Liberobacter asiaticus）高度同源，而与非洲菌系（Candidatus Liberobacter africanum）差异较大。 4．HLB病菌Southern blotting检测。利用α-32P-dCTP标记16SrDNA探针进行HLB病菌Dot-blotting检测，结果发现Dot-blotting检测灵敏度高于常规PCR而低于Semi-Nested PCR及Nested-PCR，最低检测下限为30fg总核酸。 5．CTV生物学鉴定、RT-PCR检测技术的建立及来自不同寄主的21个分离物3’端、5’端分子特性分析。以墨西哥莱檬和甜橙为指示植物，待检样品表现典型的CTV致病症状。核苷酸序列多重比对分析结果显示：21个CTV分离物的5’端和3’端共4个变异区（A区，F区，CP，P20）存在明显的差异。A区的核苷酸序列

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第1章 文献综述
• 1.柑橘黄龙病国内外研究进展
• 1.1 柑橘黄龙病分布、危害
• 1.2 柑橘黄龙病生物学特性
• 1.3 柑橘黄龙病菌的认识过程
• 1.4 柑橘黄龙病菌的诊断及检测
• 1.5 柑橘黄龙病菌分子进化特性研究
• 2.其它主要柑橘病毒病及类似病害研究概况
• 2.1 柑橘病毒病及类似病害的种类
• 2.2 柑橘病毒病及类似病害的危害及主要生物学特性
• 2.2.1 柑橘衰退病分布、危害及生物学特性
• 2.2.2 柑橘裂皮病分布、危害及生物学特性
• 2.2.3 柑橘碎叶病分布、危害及生物学特性
• 2.3 柑橘病毒病及类似病害病原性质及分子特性
• 2.3.1 CTV的主要性状及分子特性
• 2.3.2 CEVd的主要性状及分子特性
• 2.3.3 CTLV的主要性状及分子特性
• 2.4 柑橘病毒病及类似病害病原鉴定及检测技术研究概况
• 2.4.1 生物学鉴定法
• 2.4.2 镜检法
• 2.4.3 血清学方法
• 2.4.4 分子生物学方法
• 2.5 柑橘病毒病及类似病害病原脱除研究
• 2.5.1 热处理脱毒
• 2.5.2 茎尖培养
• 2.5.3 茎尖微芽嫁接脱毒
• 2.5.4 热处理结合茎尖嫁接脱毒
• 2.5.6 珠心胚培养
• 2.5.7 超低温处理脱毒
• 2.6 柑橘病毒病及类似病害的防治
• 2.6.1 交互保护作用
• 2.6.2 抗病毒基因工程
• 3 研究的目的和意义
• 第2章 HLB病菌PCR检测体系建立及亚洲株系（Candidatus Liberobacter asiaticus）分子鉴定
• 1.1 引言
• 1.2 试剂和仪器
• 1.2.1 试剂
• 1.2.2 主要仪器
• 1.3 材料与方法
• 1.3.1 实验材料
• 1.3.2 方法
• 1.4.结果与分析
• 1.4.1 生物学性状观察结果
• 1.4.2 HLB病菌显微镜观察结果
• 1.4.3 分子生物学检测结果
• 1.4.4 HLB病菌亚洲株系（Candidatus Liberobacter asiaticus）分子鉴定
• 1.4.5 Southern blotting检测结果
• 1.5 讨论
• 1.5.1 HLB病菌显微镜观察
• 1.5.2 HLB病菌PCR检测
• 1.5.3 HLB病菌16S rDNA片断PCR-RFLP及序列分析
• 1.5.4 HLB病菌16S／23S rDNA间区序列分析
• 1.5.5 HLB病菌Southern blotting检测
• 第3章 CTV、CEVd、CTLV检测技术建立及分子特性研究
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 生物学性状观察及鉴定结果
• 1.3.2 分子生物学检测结果
• 1.3.3 CTV分离物分子特性分析
• 1.3.4 CEVd分离物分子特性分析
• 1.3.5 CTLV RT-PCR检测及3'端分子特性分析
• 1.4 讨论
• 1.4.1 CTV,CEVd,CTLV生物学鉴定
• 1.4.2 CTV,CEVd,CTLV RT-PCR检测
• 1.4.3 HLB,CTV,CEVd多重RT-PCR检测
• 1.4.4 CTV分离物分子特性分析
• 1.4.5 CEVd分离物分子特性分析
• 1.4.6 CTLV分离物分子特性分析
• 第4章 超低温处理脱除HLB病菌、CTV、CEVd的初步研究
• 1.1 引言
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.2 方法
• 1.3 结果与分析
• 1.3.1 柑橘成年态茎段离体培养
• 1.3.2 玻璃化法超低温技术条件摸索
• 1.3.3 玻璃化法超低温处理脱毒
• 1.3.4 玻璃化法超低温脱毒机理的初步探讨
• 1.4 讨论
• 1.4.1 柑橘成年态茎段的离体培养
• 1.4.2 柑橘茎尖玻璃化法超低温技术的影响因素
• 1.4.3 超低温技术脱毒
• 参考文献
• 图版与图版说明
• 附录1 发表文章
• 附录2 GenBank登陆序列号
• 致谢