猪链球菌2型不同温度条件下分泌蛋白的差异研究

论文摘要

猪链球菌（Streptococcus suis）是一种重要的猪病病原体,能引起猪疫病,临床上能引起猪的高热、脑膜炎、败血症、关节炎、神经症状等。该菌有35个血清型,其中2型流行最广、且致病性最强,并能感染人,是一种重要的人畜共患病病原。目前对SS2研究较多,但其在宿主体内如何生存、繁殖并成功侵染宿主的机制还不清楚。本研究的目的就是欲通过蛋白质组学和实时荧光定量PCR两项主要技术,寻找新的毒力相关蛋白,进一步阐明SS2的发病机理。本实验以SS2的四川分离株SC-21为实验材料,建立了其在37℃常温下对数生长早期的分泌蛋白图谱,通过双向电泳技术研究了SC-21在高温条件下的分泌蛋白,并应用Image MasterTM 2D Platinum软件分析其分别在37℃（对照条件）和42℃（模拟发病猪的体温）培养条件下的分泌蛋白图谱的差异。在42℃的蛋白谱上共找到5个相对37℃表达明显上调的点,将差异蛋白点经过酶解及液相色谱—电喷雾—串联质谱（LC/ESI-MS/MS）进行鉴定分析,这五个差异蛋白分别为:核酸酶SsnA、肽聚糖水解酶CHAP、ABC转运蛋白—谷氨酸盐底物结合蛋白、假设蛋白SSU05-2101和一个未知蛋白。为了探讨差异蛋白的基因表达水平情况,我们以其中两个比较有意义的蛋白:分泌性核酸酶SsnA和肽聚糖水解酶CHAP的基因为研究对象,通过实时荧光定量PCR方法检测其在高温诱导后宿主体外和体内的mRNA水平的变化。实验结果显示,SC-21体外42℃温度诱导培养时,SsnA和的转录水平均高于对照组;体内检测发现,两个基因在急性感染SC-21的发病猪的脑、肺、脾和血液中的mRNA水平相对于健康对照猪均为上调表达,但不同组织的上调表达程度不同:SsnA基因在脑中上调表达最明显,而CHAP基因在肺中的上调表达最明显。本研究结果表明SC-21在高温的疾病状态下其部分泌蛋白的表达有一定的变化,对差异表达蛋白进行进一步的研究将有助于深入了解猪链球菌2型的致病机理,为猪链球菌病的预防和治疗提供科学的依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 综述
• 1 猪链球菌及猪链球菌病
• 1.1 猪链球菌病及其血清分型
• 1.2 猪链球菌2型的毒力（相关）因子
• 1.2.1 荚膜多糖
• 1.2.2 溶菌酶释放蛋白和胞外因子
• 1.2.3 溶血素
• 1.2.4 纤维结合蛋白
• 1.2.5 IgG结合蛋白
• 1.2.6 谷氨酸脱氢酶蛋白
• 1.3 猪链球菌2型的流行病学及可能的致病机理
• 1.3.1 猪链球菌2型的流行病学
• 1.3.2 猪链球菌2型可能的致病机理
• 1.4 猪链球菌2型的免疫与预防
• 2 蛋白质组学的研究进展
• 2.1 蛋白质组学的研究现状
• 2.2 蛋白质组学研究的主要技术
• 2.2.1 蛋白质样品制备技术
• 2.2.2 蛋白质分离技术
• 2.2.3 蛋白质组的高通量鉴定技术—生物质谱
• 2.2.4 生物信息学分析
• 2.3 分泌蛋白质组研究进展
• 2.3.1 不同环境条件下分泌蛋白质组的变化
• 2.3.2 寻找生物标志物或药物靶标
• 2.3.3 新抗生素的发现和疫苗研制
• 2.4 分泌蛋白质组学的应用前景及展望
• 3 研究目的及意义
• 第二章 猪链球菌2型分泌蛋白的差异蛋白质组学研究
• 1 前言
• 2 实验材料
• 2.1 菌株及培养基
• 2.2 主要实验仪器
• 2.3 主要化学试剂
• 2.4 主要溶液配方
• 3 方法
• 3.1 PCR鉴定菌株毒力因子
• 3.1.1 引物的设计与合成
• 3.1.2 PCR反应程序
• 3.2 SC-21菌株的培养条件
• 3.3 分泌蛋白样品的制备
• 3.4 THB培养基蛋白样品的制备
• 3.5 蛋白定量
• 3.5.1 精确定量:Quantity Kit定量
• 3.5.2 粗略定量:Bradford法
• 3.6 1D SDS-PAGE电泳
• 3.7 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）
• 3.7.1 IEF
• 3.7.2 IPG胶条平衡
• 3.7.3 灌制凝胶
• 3.7.4 胶条的转移
• 3.7.5 打开循环水浴
• 3.7.6 参数设置
• 3.7.7 凝胶染色（银染）
• 3.8 图像扫描及分析
• 3.9 差异蛋白质点的鉴定
• 3.9.1 切取蛋白点
• 3.9.2 胶内酶解
• 3.9.3 LC/ESI-MS/MS质谱分析及数据库搜索
• 3.10 实时荧光定量PCR
• 3.10.1 基本原理
• 3.10.2 总RNA的提取
• 3.10.3 cDNA的合成
• 3.10.4 引物的合成
• 3.10.5 实时荧光定量PCR检测
• 4 结果
• 4.1 PCR鉴定结果
• 4.2 分泌蛋白样品含量测定
• 4.3 两种温度条件下的分泌蛋白的1D SDS-PAGE分析
• 4.4 SC-21在两种温度条件下的分泌蛋白表达谱差异分析
• 4.5 实时荧光定量PCR的扩增结果
• 4.5.1 体外诱导培养的mRNA的相对表达水平
• 4.5.2 发热猪体内的mRNA的相对表达水平
• 5 讨论
• 5.1 关于SC-21菌株培养条件的确定
• 5.2 关于SC-21的分泌蛋白样品及LC/ESI-MS/MS鉴定方法的应用
• 5.3 高温对SC-21分泌蛋白表达谱的影响
• 5.4 实时荧光定量PCR在本研究中的应用
• 5.5 关于分泌蛋白图谱中的差异蛋白
• 5.5.1 核酸酶SsnA
• 5.5.2 肽聚糖水解酶CHAP
• 5.5.3 ABC转运蛋白—谷氨酸盐底物结合蛋白:ABC-transporter substrate-binding protein-glutamine transport
• 第三章 小结
• 参考文献
• 致谢
• 附录