H5N1亚型禽流感病毒非结构基因在大肠杆菌中的表达及初步应用

论文摘要

利用RT-PCR技术扩增了H5N1亚型禽流感病毒QS株的NS1基因,该基因核苷酸序列ORF长度为678bp,编码225个氨基酸,阅读框完整。与Genbank上登陆的NS1基因的核苷酸和氨基酸序列同源性,分别为96.9%～98.5%和95.1%～98.2%。将NS1基因重组于高效表达载体pET-28a中,经PCR、酶切鉴定及序列测定,成功地构建了重组表达载体pET-NS1,并将其转化BL21（DE3）,在37℃条件下,用终浓度1mmol/L的IPTG诱导表达5h,经15%的SDS-PAGE分析,NS1蛋白以包涵体的形式表达,其分子量大约为28 KD,说明NS1基因已在大肠杆菌中得到高效表达。用含1%的TritonX-100和2mol/L尿素的洗涤液和变性剂SKL分别洗涤和溶解包涵体,采用缓慢稀释和透析相结合的方法进行复性,获得了纯度较高,生物活性较好的NS1蛋白。 以NS1蛋白作为包被抗原,最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清的最佳稀释倍数为1:200,酶标二抗的最佳工作稀释度为1:5000,建立了检测抗NS1蛋白抗体的ELISA（NS1-ELISA）方法。重组NS1蛋白只与AIV感染的阳性血清反应,当血清1:500稀释时,仍能出现阳性反应。而不与ND、IB、IBD、EDS76的阳性血清反应。分别检测5份H9N2、H5N2和H5N1亚型灭活疫苗免疫的血清,其平均OD490值分别为0.225、0.210和0.205,均为阴性,而对5份H9N2、H5N2和H5N1亚型活毒感染后10d的血清进行检测,其平均OD490值分别为0.592、0.623和0.619,均为阳性,证明了NS1蛋白仅出现于病毒感染的细胞内,并能诱导机体产生抗NS1蛋白的抗体,而灭活疫苗免疫的鸡群不能产生该抗体。因此,NS1蛋白可作为一种鉴别诊断标记,区分野毒感染和灭活疫苗免疫鸡群,但不区分亚型,具有A型特异性,同时也可以作为一种早期诊断工具。 NS1蛋白的成功表达,为单克隆抗体的制备、功能的研究奠定了良好的基础。NS1-ELISA方法的初步应用,不仅为生产提供了一种快速、特异、敏感的鉴别诊断方法,为进一步组装成试剂盒奠定了基础,也为禽流感的早期诊断,适时监控和净化提供了行之有效的方法。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 文献综述
• 1 禽流感病毒的研究进展
• 1.1 禽流感病毒的概述
• 1.2 禽流感的流行现状及特点
• 1.3 禽流感分子生物学研究进展
• 1.4 AIV非结构蛋白的结构与功能
• 1.5 小结
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 1基因RT-PCR扩增结果'>2.1 NS₁基因RT-PCR扩增结果
• 1）的构建及鉴定'>2.2 重组克隆质粒（PMD-NS₁）的构建及鉴定
• 1）的构建及鉴定'>2.3 重组表达载体（pET-NS₁）的构建及鉴定
• 1基因的诱导表达及鉴定'>2.4 NS₁基因的诱导表达及鉴定
• 1蛋白包涵体的制备'>2.5 重组NS₁蛋白包涵体的制备
• 1蛋白的变性'>2.6 重组NS₁蛋白的变性
• 1蛋白的复性'>2.7 重组NS₁蛋白的复性
• 2.8 复性蛋白含量的测定及纯度鉴定
• 1蛋白抗体的ELISA（NS₁-ELISA）方法的建立及初步应用'>2.9 检测NS₁蛋白抗体的ELISA（NS₁-ELISA）方法的建立及初步应用
• 3 结论与讨论
• 参考文献
• 英文摘要
• 附录