论文摘要
大肠癌是临床上常见的消化道肿瘤之一,且大肠癌的发病率呈逐年上升。而肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡失衡所致,凋亡抑制是肿瘤发生的重要机制。凋亡的调节机制非常复杂,近年发现的凋亡抑制蛋白家族（IAP）是一类重要的分子水平的抗凋亡调节因子,Livin是新近发现的一个IAP家族成员,研究表明,Livin在多数肿瘤中表达,而在除胎盘外的大多数终末分化组织中低表达或不表达。在大多数研究livin在肿瘤中的表达中,认为高表达的Livin mRNA和蛋白是肿瘤进展的预兆标记,与肿瘤的发生、发展及预后相关。因此许多种以IAP为靶点的抗肿瘤研究多聚焦于Livin,通过调控Livin基因也许可以为肿瘤的治疗提供新靶点。Livin与大肠癌发生、发展、转移及预后等关系及针对Livin治疗大肠癌研究目前国内外还未见详细报道。RNA干扰技术（RNAi）是近年发展起来的新技术,RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。小干扰RNA（siRNA）选择性抑制基因表达使基因治疗达到最大的特异性,但是弱小的细胞内导入能力、有限的血液稳定性及非特异的免疫原性阻碍了siRNA基因治疗的发展。目前,国内外的研究都没能有效解决将siRNA导入体内转染细胞的效率低下的问题。基因转运需要合适的载体,理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米颗粒体积小,可在血管中随血液循环、透过血管壁进入各个脏器的细胞中,作为新型非病毒型基因载体能有效介导DNA的转导,并使其在细胞内高水平的表达,从而为基因表达、功能研究及基因治疗提供了新的技术和手段。壳聚糖（CS）是一种天然多聚糖,已有研究表明,壳聚糖纳米粒有良好的生物相容性和生物可降解性,且可通过修饰改性增加其靶向性和缓释性,是一种良好的基因载体。我们拟通过接枝共聚的方法将亲水无毒的聚乙二醇（PEG）链段引入壳聚糖链段中以增加其水溶性和缓释性,从而增加基因转染效率。基于以上背景和已有的研究成果,我们先用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA和蛋白质水平检测Livin基因的表达情况及与大肠肿瘤特性的相关性。结果显示,在所有的癌旁和正常组织中,Livin均不表达,而在肿瘤组织中,阳性表达率却达45.5%,两种方法的检测结果一致,说明Livin是大肠癌的一种标志物,这不仅有助于大肠癌的诊断,而且可以为大肠癌的生物治疗提供依据;分析Livin表达与结直肠癌患者主要临床参数之间的关系后发现,Livin在结直肠癌中表达情况与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、组织学类型、淋巴是否转移、Dukes分期均无显著相关性,而与患者远处转移及放化疗密切相关（p＜0.05）,提示Livin的表达可以影响结直肠癌的生物学行为,使其更易发生远处转移等恶性行为,是预后不良的指征之一;在放化疗后肿瘤组织中Livin表达也明显升高,提示其与肿瘤的耐药性有关。可能为大肠癌的诊断和预后判断提供新的分子生物学指标,同时也为下一步的肿瘤基因治疗提供了实验基础。在第二部分,我们设计、合成了Livin shRNA,与pGenesil-1质粒载体链接构建重组质粒,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Livin的大肠癌HT-29细胞检测Livin mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果重组质粒pGenesil-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致,说明我们成功地构建shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA重组质粒;重组质粒载体转染HT-29细胞后,肿瘤细胞livin mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降（p＜0.01）,说明我们制备的shRNA能有效抑制Livin基因的表达,其中尤以Livin1抑制作用明显,抑制率达到66%。故在后续研究中,我们均以Livin1作为实验模板,探讨针对Livin基因的RNAi对肿瘤的治疗作用。第三部分先通过接枝共聚的方法制备壳聚糖-聚乙二醇（CS-PEG）纳米粒,用透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、ζ电位,MTT法考察其细胞毒性,不同的基因/纳米粒材料比制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、ζ电位、载药量、包封率、基因保护实验考察药物的理化特性,转染后EGFP蛋白表达和LivinmRNA抑制率比较考察基因转染效果。结果制备的空白纳米粒粒径约60nm,细胞毒性较脂质体要低;在基因:纳米粒为1:5时（质量比）制备的基因纳米复合物粒径约为120nm,ζ电位为6.6mV,包封率和载药量分别为79.4%和32.3%,对基因有较好的保护作用,选此条件下制备的基因纳米复合物进行基因转染,持续作用时间较脂质体和裸基因均要长,转染72h后的Livin mRNA抑制率较两对照组明显增强（分别为p＜0.05和p＜0.01）。故后续研究中以此基因纳米复合物进行基因治疗研究。第四部分为纳米载体介导的RNAi治疗结肠癌研究。培养HT-29结肠癌细胞后,以基因纳米复合物转染,72h后用RT-PCR和westernblot检测Livin mRNA和蛋白质抑制率,用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞凋亡情况,从体外考察基因治疗效果;建立裸鼠结肠癌动物模型,以基因纳米复合物作瘤内多次注射,绘制肿瘤生长曲线,24d后切取肿瘤检测体积抑制率和瘤重抑制率,组织切片TUNEL法检测细胞凋亡指数（AI）,从动物在体模型考察基因治疗效果。结果发现试验组Livin mRNA和蛋白质的抑制率为78%和76%,较假性治疗组显著增强（p＜0.01）;试验组的肿瘤生长明显减慢,瘤重抑制率和体积抑制率分别为74%和80%,较假性治疗组明显增强（p＜0.01）;切片组织的凋亡细胞较对照组明显增多,AI增高（p＜0.01）。说明我们制备的CS-PEG纳米载体介导的Livin shRNA对Livin高表达的结肠癌有很好的治疗效果。本研究仅为“863”课题的一部分,为大肠癌基因诊断和基因治疗新策略提供了一个初步的实验基础,其开发潜能及应用于临床本课题组还会进行更深一步的实验研究。