LMP-3基因转移对骨髓间充质干细胞的调节作用及其用于治疗骨缺损的研究

论文摘要

目的:创伤、疾病所造成的骨缺损是骨科治疗的难题之一,随着DNA重组技术及基因转移技术、组织工程技术的进展,骨缺损的治疗得到了迅速发展。LMP是最近发现的一个骨生成诱导蛋白,其中LMP-1和LMP-3具有成骨作用,是成骨细胞分化的正调节因子,可以促进多种骨诱导因子的分泌,促进骨钙素的分泌和骨结节的形成,主要在骨的矿化过程中发挥重要作用。本研究借助组织工程技术,构建LMP-3真核表达质粒,研究其对骨髓间充质干细胞表型变化的影响,以明胶海绵为支架,体内研究其成骨作用,探讨其对骨缺损的修复作用。方法:应用PCR技术扩增LMP-3的功能区序列,亚克隆至真核表达质粒pEGFP-N1,最终构建重组表达质粒pEGFP-N1- LMP-3,同时进行酶切签定和测序;培养骨髓间充质干细胞,观察LMP-3对骨髓间充质干细胞表型变化的影响,以脂质体转染pEGFP-N1- LMP-3,应用RT-PCR检测骨生长标志基因LMP-3、OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp的表达,生化检测碱性磷酸酶的活性,放免法检测骨钙素的表达,以茜素红染色法观察矿化结节的形成情况,应用免疫组化的方法检测Type Collagen I的表达;制做兔桡骨缺损的动物模型,以明胶海绵为支架,复合转染pEGFP-N1- LMP-3的骨髓间充质干细胞,移植至骨缺损部位,以X线观察骨缺损的愈合情况,以HE染色观察组织的生长状态、成骨细胞和成纤维细胞的分布。结果:1、PCR扩增LMP-3基因序列正确,构建的重组表达质粒pEGFP-N1- LMP-3经EcoR1和Hind3双酶切测序鉴定正确。2、兔骨髓间充质干细胞可以成功培养,经pEGFP-N1- LMP-3转染后,骨髓间充质干细胞可以表达成骨生长标志基因OCN、Type Collagen I、ALP、Bsp,生化检测到ALP的表达,矿化结节染色阳性,放免法检测到了OCN的表达,免疫组化发现Type Collagen I的表达明显增强;而对照组除Type Collagen I有轻度表达外,其余皆为阴性结果。3、成功建立了免桡骨缺损的动物模型,实验组X线和组织学观察皆证实了骨缺损的修复,实现了骨性连接,但明胶海绵移植组和单纯细胞移植组没有见骨缺损的愈合,骨断端间为纤维组织连接。结论:成功获得真核表达重组质粒pEGFP-N1- LMP-3,为进一步研究其成骨功能奠定了基础;转染pEGFP-N1- LMP-3后,骨髓间充质干细胞可以分泌成骨生长标志基因,LMP-3功能区可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的表型转换,LMP-3功能区同其全长cDNA一样具有成骨作用;以明胶海绵为支架,骨髓间充质干细胞为种子细胞,转染LMP-3可以有效的促进骨缺损的修复,为骨缺损的治疗提供了一种新的方法。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：LMP-3 基因转移对骨髓间充质干细胞的调节作用及其用于治疗骨缺损的研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 LMP-3 功能区真核表达质粒的构建
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 PCR 扩增结果
• 2.2 pEGFP-N1/LMP-3 表达载体的酶切鉴定
• 2.3 pEGFP-N1/LMP-3 质粒测序报吿
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第二部分 pEGFP-N1/LMP-3 诱导骨髓间充质干细向成骨细胞分化的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 骨髓质干细胞培养结果
• 2.2 荧光显微镜观察转染效率
• 2.3 RNA 提取结果
• 2.4 鉴定成骨标志基因的PCR 结果
• 2.5 ALP 活性的检测
• 2.6 矿化结节的染色
• 2.7 OCN 含量的检测
• 2.8 免疫组化检测I 型胶原蛋白的表达
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第三部分 LMP-3 治疗骨缺损的初步研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 主要材料及仪器
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 术后实验动物及取材标本大体观察
• 2.2 Ｘ线检查结果
• 2.3 骨缺损修复的评分
• 2.4 组织学检查
• 3. 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 照片
• 文献综述：LIM 矿化蛋白研究进展
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的文章