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基于热休克蛋白的MUC1治疗性疫苗的研究

2020-11-22阅读(152)

基于热休克蛋白的MUC1治疗性疫苗的研究

论文摘要

MUC1是Mucins粘蛋白中的一种,存在于正常腺管上皮及其来源的肿瘤细胞表面。它是一种大分子的糖蛋白,由多肽核芯和侧枝糖链构成,其多肽核芯的胞外段含有20个氨基酸的串联重复序列（Variable numbers tandem repeats,VNTRs）。在多种肿瘤中,MUC1异常表达,主要表现为表达量增高,细胞表面极性分布的改变和结构改变等,成为免疫细胞攻击的靶点。研究发现MUC1核芯肽的PDTRP表位不仅能被MUC1抗体识别,而且也能被CTL细胞识别和杀伤,且不受MHC的限制。由于MUC1具有上述特点,成为理想的抗肿瘤靶分子。本课题的目的即是开发一种基于热休克蛋白的针对非小细胞肺癌（Non small cell lung cance,NSCLC）的MUC1治疗性疫苗。 近年来发现,热休克蛋白—多肽复合物可通过受体（CD91）介导的内吞作用被巨噬细胞吞噬,然后经过蛋白酶体降解,最终进入内源性抗原递呈途径,从而激活细胞免疫。我们选择结核分支杆菌热休克蛋白65（HSP65）与鼠BP24或人BP25基因融合来作为肿瘤的治疗性疫苗。它可以把BP24或BP25蛋白呈递给MHC-I抗原呈递途径,进而激活细胞免疫。 我们通过克隆得到鼠BP24和人BP25基因,构建了HSP65-BP24-Ztag和HSP65-BP25-Ztag的pET28a表达载体,并在大肠杆菌中得到了高效表达。目的蛋白经硫酸铵沉淀、阳离子层析、疏水层析获得了纯度超过90%的样品。经纯化的蛋白作为非小细胞肺癌的治疗性疫苗。应用HSP65-BP24-Ztag融合蛋白在小鼠Lewis肺癌细胞模型上进行免疫治疗和预防试验。结果证明,预防免疫可以使小鼠成瘤小于对照组;治疗免疫可抑制小鼠肿瘤生长,生存期延长。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一章 前言
  • 1.1 MUC1的结构
  • 1.2 MUC1的生物学功能
  • 1.2.1 MUC1在信号转导中的作用
  • 1.2.2 MUC1的粘附与抗粘附作用
  • 1.2.3 MUC1在机体免疫调节中的作用
  • 1.3 基于MUC1的抗肿瘤免疫
  • 1.3.1 MUC1在肿瘤细胞上的表达与正常细胞的不同
  • 1.3.2 MUC1诱导的抗肿瘤免疫应答
  • 1.3.3 基于MUC1的肿瘤免疫治疗
  • 1.4 以MUC1为靶点的肿瘤疫苗研制的进展
  • 1.4.1 糖链疫苗
  • 1.4.2 核酸疫苗
  • 1.4.3 痘病毒疫苗
  • 1.4.4 MUC1与抗原提呈细胞的联合应用
  • 1.4.5 蛋白或多肽疫苗
  • 1.5 热休克蛋白的特性
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌株
  • 2.1.2 质粒
  • 2.1.3 细胞及实验动物
  • 2.1.4 限制性内切酶及工具酶
  • 2.1.5 DNA及质粒回收试剂盒
  • 2.1.7 所有合成的引物
  • 2.1.8 主要仪器
  • 2.1.9 主要试剂
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 培养基
  • 2.2.2 主要溶液
  • 第三章 实验步骤
  • Ⅰ 基于热休克蛋白的鼠BP24疫苗的研究
  • 3.1 鼠BP24基因的克隆
  • 3.2 表达载体的构建
  • 3.3 表达载体转化表达菌株及目的基因的诱导表达
  • 3.3.1 表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
  • 3.3.2 目的基因的诱导表达
  • 3.4 HSP65BP24蛋白的纯化
  • 3.4.1 HSP65BP24蛋白表达方式和表达水平的确定
  • 3.4.2 HSP65BP24蛋白的硫酸铵沉淀纯化
  • 3.4.3 HSP65BP24蛋白的S柱阳离子层析
  • 3.4.4 HSP65BP24蛋白的疏水柱层析
  • 3.4.5 HSP65BP24蛋白样品的超滤浓缩
  • 3.4.6 HSP65BP24蛋白的N端氨基酸测序
  • 3.4.7 用Lowry法测定样品中的蛋白浓度
  • 3.5 工程菌5L生物反应器培养
  • 3.6 BP24多肽的化学合成
  • 3.7 动物实验测定HSP65BP24融合蛋白的活性
  • 3.7.1 Lewis细胞的培养
  • 3.7.2 预防性活性实验
  • 3.7.3 治疗性活性实验
  • Ⅱ 基于热休克蛋白的人BP25疫苗的研究
  • 3.1 人BP25基因的克隆
  • 3.2 表达载体的构建
  • 3.3 表达载体转化表达菌株及目的基因的诱导表达
  • 3.3.1 表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
  • 3.3.2 目的基因的诱导表达
  • 3.4 HSP65BP25蛋白的纯化
  • 3.4.1 HSP65BP25蛋白表达方式和表达水平的确定
  • 3.4.2 HSP65BP25蛋白的S柱阳离子层析
  • 3.4.3 HSP65BP25蛋白的疏水柱层析
  • 3.4.4 HSP65BP25蛋白样品的超滤浓缩
  • 第四章 实验结果
  • Ⅰ 基于热休克蛋白的鼠BP24疫苗的研究
  • 4.1 鼠BP24基因的克隆
  • 4.2 表达载体的构建与酶切鉴定
  • 4.3 表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
  • 4.4 HSP65BP24蛋白的纯化
  • 4.4.1 HSP65BP24蛋白表达方式和表达水平的确定
  • 4.4.2 HSP65BP24蛋白的硫酸铵沉淀纯化
  • 4.4.3 HSP65BP24蛋白的S柱阳离子层析
  • 4.4.4 HSP65BP24蛋白的疏水柱层析
  • 4.4.5 HSP65BP24蛋白的N端氨基酸测序
  • 4.5 工程菌5L生物反应器培养
  • 4.6 BP24多肽的化学合成
  • 4.7 HSP65BP24融合蛋白的动物实验评价结果
  • 4.7.1 预防性活性实验
  • 4.7.2 治疗性活性实验
  • Ⅱ 基于热休克蛋白的人BP25疫苗的研究
  • 4.1 人BP25基因的克隆
  • 4.2 表达载体的构建与酶切鉴定
  • 4.3 表达载体转化表达菌株及阳性克隆的诱导表达筛选
  • 4.4 HSP65BP25蛋白的纯化
  • 4.4.1 HSP65BP25蛋白表达方式和表达水平的确定
  • 4.4.2 HSP65BP25蛋白的S柱阳离子层析
  • 4.4.3 HSP65BP25蛋白的疏水柱层析
  • 第五章 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 附录1 略缩词表
  • 附录2
  • 致谢
  • 发表文章

    • 相关论文文献

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