P38MAPK-siRNA干预糖尿病AS及相关组织特异性FLT-1启动子的实验研究

论文摘要

目的:设计构建针对p38丝裂原活化蛋白激酶（ p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK）基因的含有绿色荧光蛋白的小干扰RNA（small siRNA）表达载体,筛选出在脐静脉内皮细胞（HUVEC）中对p38MAPK表达的抑制作用最强的质粒,证实siRNA表达载体诱导的RNA干扰技术在HUVEC中沉默p38MAPK表达的可行性。方法:设计并将化学合成的寡聚核苷酸片断与线性化的pGensil-EGFP载体连接构建针对p38MAPKα基因的3个siRNA表达载体和一个阴性对照质粒;体外转染到HUVEC细胞株中,观察荧光蛋白的表达情况,并通过RT-PCR、western blot方法观察siRNA表达载体抑制P38MAPK靶基因、蛋白表达的情况。结果:成功构建了3个含有p38MAPK-siRNA的重组质粒（psi1、psi2、psi3）和一个阴性对照重组质粒psi4,将重组质粒转染到HUVEC中,24小时后观察荧光表达,当质粒与脂质体的质量比为1:2时,转染的效率最高达到48%以上;转染psi1、psi2和psi3的HUVEC细胞中p38MAPK mRNA、蛋白表达水平降低,与对照组相比,结果均具有显著性差异,以psi1的沉默效率最高,沉默效率达77%。结论:所构建的p38MAPK-siRNA表达质粒能有效地抑制HUVEC中p38MAPK基因的表达,以psi1质粒抑制效果最佳。目的:观察p38MAPKα干扰载体psi1沉默HUVEC内p38MAPK基因的表达情况及其与TLR4致糖尿病动脉粥样硬化的关系。方法:在体外模拟糖尿病状态,即高葡萄糖、糖基化终末产物（AGE）、高胰岛素及过氧化氢刺激HUVEC,应用RT-PCR、Western blot方法检测p38MAPKα干扰载体psi1对HUVEC p38MAPK的抑制作用;并通过免疫组化、RT-PCR、Western blot观察Toll样受体-4（toll-like receptor-4,TLR4）在刺激前后的表达变化。结果:高葡萄糖、糖基化终末产物（AGE）、高胰岛素及过氧化氢任何一种刺激引起的p38MAPK的增高都可被psi1抑制到正常水平;同时上述4种刺激因素会增加TLR4在HUVEC的表达,并被psi1抑制。结论:P38MAPKα干扰质粒psi1可有效抑制p38MAPK和TLR4的表达,为糖尿病动脉粥样硬化的基因治疗提供实验基础和理论依据。目的:构建含有组织特异性胎儿肉瘤样酪氨酸激酶-1（fms-like tyrosine kinase-1, FLT-1）启动子的真核表达载体,检测其转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后对荧光素酶报告基因表达的驱动能力,从而探讨应用FLT-1启动子实现组织特异性靶向基因治疗的可行性。方法:PCR扩增FLT-1启动子,插入到pGL3-Basic-luc载体中,构建携带FLT-1启动子的真核表达载体pGL3-FLT-Basic-luc,经脂质体法转染HUVEC、HepG2、NIH3T3和HEK293细胞,于转染48h后采用双荧光报告系统检测荧光素酶表达活性;并予以高糖、高胰岛素、AGE、H2O2刺激HUVEC观察FLT-1mRNA表达水平及FLT-1启动子活性。结果:酶切及测序证实构建的pGL3-FLT-Basic-luc载体中含有序列正确的FLT-1基因启动子,其在HUVEC细胞的荧光素酶活性明显高于HEK293细胞（p<0.01）,而在HepG2和NIH3T3细胞中未检测出荧光素酶表达。高葡萄糖、糖基化终产物、高胰岛素和过氧化氢刺激后FLT-1mRNA表达明显增加,FLT-1启动子的转录活性也明显升高,最高达66%（以pGL3-promoter的启动子活性为100%）。结论:本研究克隆的FLT-1启动子具有较高的血管内皮特异性转录活性,高糖、高胰岛素、AGE、H2O2刺激可增强其转录活性,故可作为动脉粥样硬化（AS）基因治疗的靶向血管内皮的启动子来源。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 P38MAPK-siRNA 真核表达质粒的构建与筛选
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第二部分 P38MAPK-siRNA 体外序列特异性抑制P38MAPK 的表达的及其与TLR4 的关系
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 第三部分 组织特异性FLT-1 启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其在血管内皮细胞中特异生物活性的研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 参考文献
• 全文总结
• 文献综述
• 致谢
• 攻读博士学位期间参与申报的主要课题和发表的主要论文