小鼠种质安全保存方法和体系的研究

论文摘要

本研究利用活体保种、精子冷冻及辅助生殖技术建立了一套安全的综合性保种体系。实验设计以单侧睾丸摘除方法获得ICR、BDF1、C57BL/6J和GFP四种小鼠的附睾精子进行冷冻保存实验,手术后恢复的公鼠继续用于自然繁育。如果无法自然繁育,则将冻融精子用于体外受精(IVF)。如果冻融精子经体外受精仍无法获得后代,则需要借助卵胞质内单精子注射技术(ICSI)进行胚胎构建。以上两种方法还需要通过胚胎移植来获得后代仔鼠。结果单侧睾丸摘除的BDF1、C57BL/6J公鼠可以继续繁育得到后代；对不育的ICR和GFP小鼠的冻融精子实施IVF后,只有ICR小鼠可以得到正常的胚胎和仔鼠;而以C57BL/6J为遗传背景的GFP转基因小鼠,其冻融精子只有采用ICSI技术,才可以得到仔鼠。本文证实了精子冻融小鼠的遗传背景是影响IVF成功与否的关键性因素,同时建立了一种以小鼠精子为主导的综合性保种体系,既可以达到品系保存的目的,又实现了对小鼠品系最大限度的利用。再ICSI技术支撑下,进一步研究慢速冷冻对。ICSI及孤雌激活卵／合子的影响。实验首先对小鼠卵母细胞进行ICSI和孤雌激活,0h、1h、5h后分别进行慢速冷冻保存。复苏后统计卵母细胞／合子的成活率、受精率／激活率和胚胎发育率,并观察细胞骨架和倍型变化。实验发现：ICSI后0h、1h、5h三组间以及孤雌激活0h、1h、5h三组间冷冻存活率均存在显著差异(p<0.05)；ICSI后0h、1h、5h三组存活受精卵中双原核率也有显著差异(p<0.05),而且孤雌激活1h、5h组双原核率也存在显著差异(p<0.05)。尽管这些组间存在显著差异,但是出现双原核的受精卵或者孤雌卵子囊胚发育率无显著差异。相对于处理5h后冷冻的ICSI卵子和孤雌激活卵子,处理0h和1h后冷冻的ICSI卵子和孤雌激活卵子有更多的不正常倍型的合子,说明过短时间的冷冻前处理可能会导致一些激活卵子形成不正常的倍型。而且实验发现,在ICSI后立刻冷冻的卵子中,复苏的精子头依然能够在卵子中维持正常的受精能力且不影响胚胎早期发育。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 冷冻保存原理
• 1.2 冷冻损伤
• 1.3 小鼠精子冷冻保存
• 1.4 小鼠胚胎冷冻
• 1.5 小鼠卵母细胞冷冻保存
• 1.6 小鼠胚胎与配子冷冻的应用
• 1.7 本刊研究的意义
• 2 一种新颖的小鼠保种体系
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.3 实验设计
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 公鼠单侧睾丸摘除手术
• 2.4.2 R18S3精子冷冻液配制方法
• 2.4.3 精液的收集与冷冻保存
• 2.4.4 单侧睾丸摘除小鼠的自然交配
• 2.4.5 冷冻精子的复苏
• 2.4.6 冻融精子的体外受精
• 2.4.7 小鼠的超排处理及卵子的收集
• 2.4.8 冻融精子的卵胞质内注射
• 2.4.9 胚胎移植
• 2.5 结果
• 2.5.1 单侧睾丸摘除公鼠的自然交配
• 2.5.2 ICR和GFP小鼠冷冻精子的体外受精
• 2.5.3 GFP小鼠冻融精子的显微受精
• 2.6 讨论
• 3 ICSI及孤雌激活小鼠多卵子的冷冻
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 主要试剂及仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 ICSI用针及拣卵针的制作
• 3.3.2 附睾尾精子的收集和冷冻
• 3.3.3 小鼠的超排处理及卵子的收集
• 3.3.4 冷冻精子的复苏
• 3.3.5 ICSI
• 3.3.6 卵子的孤雌激活
• 3.3.7 卵母细胞的慢速程序化冷冻
• 3.3.8 冷冻卵母细胞的快速解冻
• 3.3.9 免疫组化及激光共聚焦显微观察
• 3.4 数据统计
• 3.5 结果
• 3.5.1 ICSI并培养不同时间和孤雌激活不同时间后冷冻复苏存活率
• 3.5.2 冷冻ICSI及孤雌激活卵子复苏5hrs后的倍型
• 3.5.3 双原核卵母细胞的囊胚发育率
• 3.5.4 孤雌激活后冷冻复苏卵母细胞的倍型及发育率
• 3.5.5 ICSI卵子冷冻复苏后纺锤体和核的变化
• 3.6 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录A
• 附录B
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢