五种水生植物内生真菌多样性及其代谢产物研究

论文摘要

植物内生菌（Endophyte）是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物组织或器官内部的真菌或细菌,其存在一般不引起宿主产生可见的病症。近年来研究发现内生真菌有着丰富的生物多样性和次生代谢产物多样性。本论文对华凤仙（Impatiens chinensis L.）、问荆（Equisetum arvenwe L.）、多对碎米荠（Cardamine multijuga）、海菜花（Ottelia acuminata）和轮叶狐尾藻（Myriophyllum verticillatum L.）五种水生植物进行了内生真菌多样性研究；并对多对碎米荠内生菌株C2产的色素化合物进行了分离纯化和结构鉴定。从五种植物中共分离到内生真菌214株,总分离频率为36%,多对碎米荠、海菜花、华凤仙、轮叶狐尾藻、问荆内生真菌的分离频率分别为30%、18%、41%、28%和63%。分离结果表明,五种水生植物的定殖率各不相同（定殖率从18%到63%）（X-2=51.128, P<0.001, Chi-square test）,挺水植物的分离频率明显高于沉水植物。经鉴定,内生真菌分属于枝孢属（Cladosporium）、交链孢属（Alternaria）和曲霉属（Aspergillus）等31个不同的分类单元。其中半知菌（mitosporic fungi）,子囊菌（Ascomycete）和无孢类群（sterile mycelia）的比例分别为79%,0.5%和21%。其中华凤仙中的优势属为枝孢属（47.9%）和地霉属（Geotrichum）（16.7%）；问荆中的优势属为镰孢霉属（29.2%）和枝孢属（13.9%）；轮叶狐尾藻中的优势属为枝孢属（20%）和地霉属（14.3%）。海菜花中的优势属为枝孢属（23.2%）和毛霉属（Mucor） （17.9%）;多对碎米荠中的优势属为枝孢属（33.1%）和地霉属（20.4%）。以香蕉疫霉（Phytophthora nicotianae）和腐皮镰刀菌（Fusarium solani）两种植物病原菌为测试菌种,对这五种植物的内生真菌进行了抗菌活性初筛。结果表面,214株内生真中,有96株对香蕉疫霉或腐皮镰刀菌具有不同程度的抗菌活性,活性菌株占总分离菌株的44.9%,其中抑菌活性在30%以上的菌株有28株（占总菌株的16.46%）。以杨桃炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、香蕉疫霉和腐皮镰刀菌等6种植物病原菌为指示菌,对内生真菌活性菌株比率较大的华凤仙、问荆和轮叶狐尾藻三种水生植物内生真菌代谢产物进行抗菌活性复筛研究。结果表明,有37株内生真菌（占分离菌株总数的23.9%）显示出对一种或多种病原菌的抑菌活性。来自华凤仙、问荆和轮叶狐尾藻的抗菌活性菌株比例分别为29.2%、13.9%及37.1%,都远低于已报道的陆生植物内生真菌中活性菌株的比例。抗菌活性菌株主要分布于枝孢属、木霉属（Trichoderma）和地霉属（Geotrichum）等5个属中。通过人工发酵培养,利用层析技术,从多对碎米荠内生真菌C2的培养液中分离得到2个蒽醌类化合物。根据核磁共振C谱（CNMR）、H谱（HNMR）、DEPT谱和质谱（MS）等波谱数据和查阅相关文献,确定化合物Ccrmal为蒽茜素（skyrin）（1,1,6,6,8,8-六羟基-3,3-二甲基连二蒽醌）,化合物Ccrma2为大黄素（emodin）（1,6,8-三羟基-3-甲基蒽醌）。经查阅文献发现,从隐孢丛赤壳属（cryphonectria radicalis）代谢产物中分离到以上两个化合物属首次报道。根据菌株C2的形态特征、产孢方式和孢子特征,再结合其ITS序列分析结果（GeneBank中序列号为GU109283）,将菌株C2鉴定为隐孢丛赤壳菌（Cryphonectria radicalis）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 插图和附表清单
• 缩略词
• 第一章 前言
• 1.1 植物内生真菌
• 1.1.1 植物内生真菌的概念及其多样性
• 1.1.2 植物内生真菌的生物学意义
• 1.1.2.1 促进植物生长作用
• 1.1.2.2 增强宿主植物的抗逆性
• 1.1.2.3 对植物群落及生态系统产生影响
• 1.1.3 植物内生真菌产生的活性物质
• 1.1.3.1 抗肿瘤物质
• 1.1.3.2 抗菌物质
• 1.1.3.3 产酶的内生菌
• 1.2 水生植物及水生植物内生真菌简介
• 1.3 微生物色素的开发利用
• 1.3.1 微生物色素简介
• 1.3.2 产天然色素的微生物培养条件的研究进展
• 1.3.2.1 培养基成分对微生物生产天然色素的影响
• 1.3.2.2 不同添加物对微生物生产天然色素的影响
• 1.3.3 产天然色素的微生物发酵工艺的研究进展
• 1.3.3.1 菌种联合培养
• 1.3.3.2 固定化细胞技术
• 1.3.4 微生物色素代谢工程研究进展
• 1.3.4.1 引入外源基因,构建色素工程菌
• 1.3.4.2 改变代谢途径,促进色素合成
• 1.3.4.3 利用遗传修饰,调控色素合成
• 1.4 本课题的研究目的、意义和内容
• 第二章 云南5种水生植物内生真菌多样性及其抗菌活性研究
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 样品简介
• 2.1.2 病原指示菌
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 水生植物的采集
• 2.2.2 内生真菌的分离纯化
• 2.2.3 内生真菌的鉴定
• 2.2.4 活性菌株的初筛
• 2.2.5 活性菌株的复筛
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 内生真菌分离结果
• 2.3.2 活性菌株的初筛
• 2.3.3 活性菌株的复筛
• 2.3.3.1 内生真菌菌株的抗菌活性
• 2.3.3.2 抗菌活性菌株的宿主分布
• 2.3.3.3 小结
• 第三章 隐孢丛赤壳两个蒽醌化合物的分离纯化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 试验仪器
• 3.1.2 常用试剂
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 形态鉴定
• 3.2.2 分子鉴定
• 3.2.2.1 基因组DNA提取
• 3.2.2.2 PCR扩增与序列测定
• 3.2.3 活性化合物分离纯化
• 3.2.3.1 薄层层析（TLC）
• 3.2.3.2 硅胶柱层析
• 3.2.3.3 LH-20凝胶柱层析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 鉴定结果
• 3.3.1.1 菌株C2形态鉴定结果
• 3.3.1.2 菌株C2分子鉴定结果
• 3.3.2 C2菌株的两个蒽醌化合物的分离纯化
• 3.3.2.1 C2菌株的发酵
• 3.3.2.2 提取与萃取
• 3.3.2.3 化合物Ccrma1的分离纯化
• 3.3.2.4 化合物Ccrma2的分离纯化
• 3.3.3 两个蒽醌化合物的结构解析
• 3.3.3.1 Ccrma1的结构解析
• 3.3.3.2 Ccrma2的结构解析
• 第四章 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录
• 附录B