钩端螺旋体腺苷甲硫氨酸依赖型氧甲基化酶和人线粒体外膜蛋白mitoNEET的结构生物学研究

论文摘要

第一部分钩端螺旋体腺苷甲硫氨酸依赖型氧甲基化酶的晶体学研究对所有的生物而言,甲基化是一个重要而又普遍存在的生物学过程。绝大部分的甲基化酶采用腺苷甲硫氨酸作为甲基供体,甲基化完成后腺苷甲硫氨酸转化为腺苷高胱氨酸。在致病性细菌问号型钩端螺旋体全基因组测序完成后,基因LA0415的产物被注释为腺苷甲硫氨酸依赖型氧甲基化酶（LiOMT）。经序列分析LiOMT被归为Methyltransf3蛋白家族（Pfam PF01596）,在这个家族中细菌来源的所有已知功能的5个甲基化酶均被报道参与抗生素合成。我们用大肠杆菌大量表达了LiOMT并得到晶体。在晶体结构中LiOMT结合有腺苷高胱氨酸配基,展示出非常保守的腺苷甲硫氨酸（腺苷高胱氨酸）结合区域和独特的金属离子依赖的催化区域。LiOMT分子通过N端的交换形成同二聚体,据文献报道这种二聚的形式能够在没有底物结合的情况下促进底物结合区预折叠。LiOMT的催化区域和底物结合区域的一级序列和三维结构预示它的底物是一种酚类化合物,这种酚类化合物可能带有一个大环形状的尾巴。这是Methyltransf3家族中的第一个细菌来源的结构,LiOMT晶体结构也给这个家族中其他细菌来源的抗生素合成相关蛋白提供了可供参考的结构信息。第二部分人线粒体外膜蛋白mitoNEET的晶体学研究mitoNEET是新近被发现的线粒体外膜蛋白,它能够特异性结合抗Ⅱ型糖尿病的药物吡格列酮。我们对mitoNEET的细胞质可溶部分(mitoNEET33-108)进行了结构解析。mitoNEET33-108拥有一个全新的折叠类型,并含有一个[2Fe-2S]铁硫中心。这个铁硫中心与mitoNEET33-108的Cys72,Cys74,Cys83和His87配位,相对于已知的4个Cys配位和2个Cys、2个His配位的[2Fe-2S]铁硫中心来说,这种3个Cys、1个His的配位类型也是在自然界中第一次发现。mitoNEET33-108在溶液中和在晶体结构中都形成同二聚体,两个单体通过界面间的疏水相互作用以及两个水分子介导的氢键相互作用结合在一起。与[2Fe-2S]铁硫中心配位的His-87暴露在二体的表面,对铁硫中心的功能起着重要作用。我们推测mitoNEET在线粒体外膜上形成二体,并通过二体表面上靠近[2Fe-2S]铁硫中心的区域与其它蛋白相互作用。第三部分大肠杆菌膜蛋白二酯酰甘油激酶的初步晶体学研究大肠杆菌膜蛋白二酯酰甘油激酶（DAGK）是一个分子量为13 kDa的小蛋白,它能催化脂分子二酯酰甘油（DAG）和MgATP磷酸化反应生成另一种脂分子卵磷脂（PA）和MgADP。它在膜上形成三体,每个单体三次跨膜,很可能三个单体共同参与磷酸转移反应。大肠杆菌DAGK代表了一类微生物DAGK,它们与其它所有已知的DAGK都没有序列同源性,却和其它DAGK一样催化复杂的磷酸转移反应。得到大肠杆菌的晶体结构有利于我们了解这类独特的激酶的分子机理。我们对DAGK进行了表达、纯化和晶体筛选,目前已经得到可以衍射的晶体,衍射分辨率为20（?）的衍射点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 钩端螺旋体腺苷甲硫氨酸依赖型氧甲基化酶（LiOMT）的晶体学研究
• 第一章 绪论
• 1.1 甲基化酶背景知识介绍
• 1.1.1 甲基化酶概论
• 1.1.2 基于底物对甲基化酶的分类
• 1.1.2.1 以蛋白质为底物的甲基化酶
• 1.1.2.2 以DNA为底物的甲基化酶
• 1.1.2.3 以RNA为底物的甲基化酶
• 1.1.2.4 以小分子为底物的甲基化酶
• 1.1.2.5 以脂类为底物的甲基化酶
• 1.2 LiOMT的研究背景
• 1.2.1 LiOMT来源于问号型钩端螺旋体
• 1.2.2 LiOMT属于以小分子为底物的甲基化酶家族
• 1.2.3 Pfam PF01596家族中LiOMT的同源蛋白
• 1.2.3.1 咖啡酰辅酶A氧甲基化酶
• 1.2.3.2 儿茶酚氧甲基化酶
• 1.2.3.3 细菌来源的抗生素合成相关氧甲基化酶
• 1.3 本课题的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 蛋白表达和纯化
• 2.1.1 基因克隆及表达载体构建
• 2.1.2 蛋白表达
• 2.1.3 蛋白纯化
• 2.2 溶液中蛋白聚合状态检测
• 2.3 结晶和数据收集
• 2.3.1 晶体筛选
• 2.3.2 数据收集
• 2.4 结构测定
• 2.5 蛋白底物相关实验
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 蛋白表达和纯化
• 3.2 溶液中蛋白聚合状态检测
• 3.3 LiOMT的晶体结构
• 3.4 与其他氧甲基化酶的比较
• 3.5 LiOMT底物预测
• 参考文献
• 第二部分 人线粒体外膜蛋白mitoNEET的晶体学研究
• 第一章 绪论
• 1.1 mitoNEET的研究背景
• 1.1.1 糖尿病与治疗药物
• 1.1.2 mitoNEET的发现
• 1.1.2.1 引言
• 1.1.2.2 mitoNEET与吡格列酮相互作用
• 1.1.3 mitoNEET的功能研究进展
• 1.1.3.1 mitoNEET拥有特殊的CDGSH-锌指结构域
• 1.1.3.2 所谓的CDGSH-锌指蛋白结合的是铁元素
• 1.1.3.3 mitoNEET的亚细胞定位
• 1.1.3.4 mitoNEET的mRNA和蛋白是广泛表达的
• 1.1.3.5 mitoNEET由一段N端信号序列引导定位至线粒体外膜上
• 1.1.3.6 mitoNEET是一个朝向细胞质的整合外膜蛋白
• 1.1.3.7 mitoNEET调节线粒体氧化容量
• 1.2 已知含铁的蛋白在线粒体氧化磷酸化中的作用
• 1.2.1 线粒体氧化磷酸化
• 1.2.1.1 复合物Ⅰ
• 1.2.1.2 复合物Ⅱ
• 1.2.1.3 复合物Ⅲ
• 1.2.1.4 复合物Ⅳ
• 1.2.1.5 复合物Ⅴ
• 1.2.2 铁硫中心
• 1.3 mitoNEET的研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 蛋白表达和纯化
• 2.1.1 基因克隆及表达载体构建
• 2.1.1.1 LIC克隆
• 2.1.1.2 pMCSG9载体
• 33-108载体构建'>2.1.1.3 pMCSG9-mitoNEET_33-108载体构建
• 27-108载体构建'>2.1.1.4 pET28b-mitoNEET_27-108载体构建
• 2.1.2 蛋白表达
• 27-108的表达'>2.1.2.1 mitoNEET_27-108的表达
• 2.1.2.2 TEV蛋白酶的表达
• 33-108的表达'>2.1.2.3 mitoNEET_33-108的表达
• 2.1.3 蛋白纯化
• 27-108的纯化'>2.1.3.1 mitoNEE_27-108的纯化
• 2.1.3.2 TEV蛋白酶的纯化
• 33-108的纯化'>2.1.3.3 mitoNEE_33-108的纯化
• 2.2 紫外-可见光吸收光谱
• 2.3 ICP-MS定量分析铁元素
• 2.3.1 ICP-MS简介
• 2.3.2 ICP-MS测量低PH下mitoNEET中铁元素的去向
• 2.4 结晶和数据收集
• 2.4.1 晶体筛选
• 2.4.2 数据收集
• l22）'>2.4.2.1 第一套数据:用于解决相位（I4_l22）
• l22）'>2.4.2.2 第二套数据:用于提高衍射分辨率（I4_l22）
• l2_l2_l'>2.4.2.3 第三套数据:另一种空间群P2_l2_l2_l
• 2.4.3 结构测定
• 2.4.3.1 SAD法求解相位的原理
• 2.4.3.2 mitoNEET结构测定
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 蛋白表达和纯化
• 27-108的表达和纯化'>3.1.1 mitoNEET_27-108的表达和纯化
• 33-108的表达和纯化'>3.1.2 mitoNEET_33-108的表达和纯化
• 3.2 紫外-可见光光谱
• 3.3 ICP-MS测量低PH下mitoNEET中铁元素的去向
• 3.4 mitoNEET的晶体结构
• 33-108整体结构'>3.4.1 mitoNEET_33-108整体结构
• 3.4.2 [2Fe-2S]铁硫中心和铁硫中心结合结构域
• 3.4.3 mitoNEET的二体结构
• 3.4.4 mitoNEET上可能的吡格列酮结合位点
• 参考文献
• 第三部分 大肠杆菌膜蛋白二酯酰甘油激酶的初步晶体学研究
• 第一章 绪论
• 1.1 二酯酰甘油激酶DAGK的背景知识介绍
• 1.1.1 DAGK概述
• 1.1.2 大肠杆菌DAGK
• 1.2 膜蛋白结晶概述
• 1.3 本课题的研究意义
• 第二章 初步研究进展
• 2.1 DAGK的表达和纯化
• 2.2 DAGK的晶体筛选和优化
• 2.3 DAGK的晶体衍射
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果