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CDK2在疱疹病毒复制中作用的研究

2020-11-28阅读(596)

CDK2在疱疹病毒复制中作用的研究

论文摘要

疱疹病毒宿主广泛，引起人和许多动物多种多样的感染。除急性感染外，还有潜伏感染和反复发作的倾向。疱疹病毒复制机理的研究对发展病毒与宿主细胞相互作用的理论、抗病毒药物的开发以减轻疱疹病毒对人类健康的威胁、减少牛业的巨大经济损失有重要意义。疱疹病毒等大DNA病毒能编码DNA聚合酶等DNA复制相关蛋白，且能在静止细胞甚至终末分化的神经细胞中复制，因此过去认为这些病毒的复制与细胞周期无关，不需要细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK）的活性。1998年发现，药理学剂量的CDK抑制剂（PCI）能抑制单纯疱疹病毒（HSV）的复制。此后，CDK在病毒复制过程中的作用备受关注，而HSV成为研究病毒与宿主细胞相互作用的首选模型。目前对于HSV等病毒复制所需CDK种类还不清楚。根据文献资料分析和我们的前期实验结果，我们的假设是：CDK2可能是HSV复制和重新激活的关键性启动因素。本文以表达显性负突变体CDK2（dn-CDK2）的HT29Tet-Ondn-CDK2细胞系、靶向CyclinA、CyclinE及CDK2的干扰RNA等多种措施抑制CDK2活性，研究CDK2在HSV复制中的作用。结果发现，HSV在CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2细胞中的增殖具有感染剂量依赖性；HSV感染宿主细胞6小时后CDK2活性被诱导；HSV增殖动力学分析表明在宿主细胞CDK2活性被诱导后，HSV即进入了快速增殖阶段。这一发现首次直接证明了CDK2活性与HSV复制的关系。用微球菌核酸酶（MCN）消化进行的尝试性实验发现：HSV感染CDK2下降细胞5小时后其基因组DNA仍以结构紧密的染色体形式存在，HSV基因组的存在形式与宿主细胞CDK2活性有关。这一发现为进一步研究CDK2调控HSV基因转录的机制提供了线索。1．HSV在HT29Tet-On dn-CDK2细胞中的增殖特性HT29Tet-On dn-CDK2细胞整合了受Tet-On启动子调控的dn-CDK2基因，在强力霉素（Dox）诱导下大量表达dn-CDK2蛋白而抑制细胞CDK2的活性。将HT29Tet-On dn-CDK2细胞在有和无Dox条件下培养48小时，然后用不同剂量的HSV感染dn-CDK2诱导表达和未诱导表达的HT29Tet-On dn-CDK2细胞，24小时后收获细胞，测定感染性HSV颗粒的生成量。结果发现：高感染剂量的HSV（大于1PFU／Cell）在dn-CDK2诱导表达和未诱导表达的HT29Tet-Ondn-CDK2细胞中的生长无明显差别，而低感染剂量（小于0．3PFU／Cell）的HSV感染dn-CDK2诱导表达的HT29Tet-On dn-CDK2细胞24小时后感染性HSV颗粒的生成量较未诱导的HT29Tet-On dn-CDK2细胞中要低10倍以上。说明HSV在dn-CDK2诱导表达的HT29Tet-On dn-CDK2细胞中的生长具有感染剂量依赖性。这一现象与ICP0功能缺陷型HSV在培养细胞中的行为相似。提示细胞CDK2或者其产物有可能是HSV ICP0蛋白功能的替代者。2．HSV复制与CDK2活性的关系为进一步分析HSV能在CDK2功能缺陷型宿主细胞HT29Tet-On dn-CDK2中增殖的原因，我们用HSV感染Dox充分诱导的HT29Tet-On dn-CDK2细胞，每隔3小时收获细胞，测定CDK2的活性。结果发现，HSV感染6小时后，Dox诱导的HT29Tet-On dn-CDK2细胞中CDK2活性开始升高，9小时达到最大，12小时活性下降。HSV的增殖动力学分析结果发现，HSV感染非诱导的HT29Tet-Ondn-CDK2细胞6小时时感染性HSV颗粒的生成量最低，9小时后病毒产量上升。而感染dn-CDK2诱导表达的HT29Tet-On dn-CDK2细胞9小时时感染性HSV颗粒的生成量最低，12小时后病毒产量上升。较在未诱导的HT29Tet-On dn-CDK2细胞中的复制延迟3小时。这9小时恰好是CDK2活性被诱导所需要的时间，CDK2活性被诱导后HSV才进入了快速复制阶段。这一发现提示HSV的复制与CDK2活性密切相关；HSV通过诱导宿主细胞CDK2活性而促进了其本身复制的启动。3．靶向CDK2的siRNA对HSV的复制的抑制作用为进一步验证CDK2在HSV复制中的作用，我们构建了靶向CDK2、CyclinA、CyclinE的siRNA表达载体，共转染Vero细胞，观察重组病毒HSV-GFP在CDK2活性被抑制的转染细胞中的基因表达情况。发现未转染CDK2 siRNA的细胞HSV-GFP基因表达正常，而转染CDK2 siRNA抑制了CDK2的活性后，HSV的HSV-GFP基因表达也受到了抑制。进一步证明了CDK2在HSV复制中的重要性。靶向CDK2、CyclinE和CyclinA的siRNA联合作用对HSV复制的抑制程度最强。4．宿主细胞CDK2活性对HSV染色体构象的影响真核生物基因的转录活性与染色体的结构状态密切相关。我们推论上述HSV在CDK2活性下降细胞中的复制延迟可能与HSV染色体构象有关。为验证这一假设，我们提取了5PFU／Cell的HSV感染Dox诱导和非诱导的HT29Tet-Ondn-CDK2细胞5小时后的细胞核，用微球菌核酸酶（MCN）消化染色体，电泳分离后印渍到硝酸纤维素膜上，用HSV基因探针杂交，测定HSV基因组被MCN消化程度。结果发现HSV在感染CDK2活性正常的HT29Tet-On dn-CDK2细胞5小时后基因组DNA被MCN作用5分钟即被降解成DNA片断，而感染CDK2活性下降的HT29Tet-On dn-CDK2细胞5小时后HSV基因组被MCN作用30min仍然没有降解，表明HSV基因组DNA可能与组蛋白结合紧密，以致密的染色体构象形式存在。提示HSV感染宿主细胞后其染色体的结构状态与CDK2活性有关，CDK2有可能通过促进HSV基因组DNA由紧密的染色体结构状态转变为松散状态而促进了HSV复制的起始。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 参考文献
  • 第一章 HSV在CDK2功能缺陷型细胞中的增殖特性
  • 第一节 Dox对HT29Tet-On dn-CDK2细胞增殖及CDK2活性的抑制作用
  • 1 材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 4 讨论
  • 5 结论
  • 第二节 HSV在HT29Tet-On dn-CDK2细胞中的生长
  • 1 材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 4 讨论
  • 5 参考文献
  • 第二章 HSV复制与宿主细胞CDK2活性关系的研究
  • 1 材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 4 讨论
  • 5 参考文献
  • 第三章 靶向CDK2的siRNA对HSV的复制的抑制作用
  • 1 材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 4 讨论
  • 5 参考文献
  • 第四章 CDK2在HSV复制中作用机制的初步探索
  • 1 材料
  • 2 实验方法
  • 3 实验结果
  • 4 讨论
  • 5 参考文献
  • 结论
  • 文献综述
  • 第五章 HSV复制与细胞周期蛋白关系的研究进展
  • 1 HSV概况
  • 2 HSV与细胞周期
  • 3 HSV与CDK
  • 4 展望
  • 5 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间已发表和待发表的博士论文相关文章

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