论文摘要
第一部分丙炔苯丙胺通过上调抗氧化蛋白NQ01表达保护1-甲基-4-苯基吡啶离子所致PC12细胞损伤目的本部分研究旨在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的PC12细胞模型中证实丙炔苯丙胺的神经保护作用,并对其保护机制进行初步探索。方法应用1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）处理PC12细胞制备PD的细胞模型。采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）、细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放量检测、活性氧蔟（ROS）含量检测、四唑氮蓝/甘氨酸盐法行醌结合蛋白检测、Western Blots等方法检测丙炔苯丙胺对MPP+所致PC12细胞损伤的保护作用,初步探索丙炔苯丙胺是否通过间接的抗氧化作用发挥细胞保护效应。结果MTT法和LDH释放量检测均显示,不同浓度丙炔苯丙胺预处理可以显著减轻MPP+导致的PC12细胞损伤。ROS含量测定以及四唑氮蓝/甘氨酸盐法醌蛋白浓度检测的结果显示,不同浓度丙炔苯丙胺预处理明显地逆转了MPP+导致的氧化应激标志物增高。Western blots检测细胞内辅酶Ⅰ醌类氧化还原酶1（NQO1）蛋白表达及二氯靛酚反应法测定NQO1活性的结果显示,不同浓度的丙炔苯丙胺可以导致该抗氧化蛋白的表达量和酶活性均呈现出剂量依赖式的增高。另外,LDH释放量检测结果显示,双香豆素抑制NQO1后,丙炔苯丙胺对细胞的保护作用被逆转了。结论丙炔苯丙胺可以通过上调抗氧化蛋白NQO1的表达和活性,减少氧化应激损伤标志物的生成,发挥对MPP+所致的PC12细胞损伤的保护作用。第二部分丙炔苯丙胺通过促进Nrf2核转位介导PC1 2细胞抗氧化蛋白NQ01表达和活性增高目的验证丙炔苯丙胺是否通过促进核因子红系2相关因子2（Nrf2）核转位介导PC12细胞抗氧化蛋白NQO1表达和酶活性增高。方法应用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒分别提取PC12细胞的胞浆胞核蛋白,再采用Western blots技术检测胞浆胞核中Nrf2的蛋白含量变化；采用Nrf2小分子干扰RNA （SiRNA）转染技术,进一步验证Nrf2在丙炔苯丙胺诱导NQO1酶活性上调过程中的作用。结果Western blots结果表明,在MPP+的单独处理下,PC12细胞胞浆和胞核的Nrf2含量都出现了减少。而丙炔苯丙胺预处理可以有效地减少胞浆内的Nrf2含量,增加核内Nrf2的含量,且其胞浆内Nrf2的相对表达水平比MPP+单独处理时还要低,差异均有统计学意义。在转染了Nrf2 SiRNA的PC12细胞中,NQO1的活性出现了明显降低。另外,在Nrf2基因被沉默后,丙炔苯丙胺所导致的NQO1酶活性上调也消失了结论丙炔苯丙胺所导致的抗氧化蛋白NQO1酶活性增强是通过促进Nrf2核转位,从而驱动NQO1转录增强这一途径完成的。第三部分Akt和Erk信号通路在丙炔苯丙胺抗氧化应激介导的PC12细胞保护机制中的作用目的本部分研究旨在探索丙炔苯丙胺促进Nrf2核转位的上游激酶调控通路,并观察丙炔苯丙胺对B型单胺氧化酶（MAOB）勺抑制作用是否也参与了Nrf2的激活过程。方法应用Western Blots方法检测PC12细胞中Akt和细胞外信号调节激酶（Erk）等激酶的磷酸化水平变化,并应用各种激酶抑制剂处理PC12细胞观察各个激酶对Nrf2和NQO1的调控作用。另外,我们应用MAOB和Nrf2 SiRNA转染,来分析丙炔苯丙胺对MAOB抑制作用是否影响了Nrf2介导的抗氧化反应。结果经过Western blots法检测,我们发现,丙炔苯丙胺处理PC12细胞可以诱导Akt和Erk的磷酸化水平呈时间依赖性增高。另外,丙炔苯丙胺介导的Nrf2核转位和NQO1表达增高被可以被PD98059部分阻断,而P13K的抑制剂LY294002几乎完全地取消了丙炔苯丙胺导致的Nrf2核转位和NQO1表达增高。对SiRNA转染的PC12细胞的ROS测定表明,MAOB基因沉默可以使ROS含量出现少量的下降,但并不影响丙炔苯丙胺的抗氧化活性。而且,无论MAOB基因沉默与否,Nrf2 SiRNA转染的PC12细胞清除ROS的能力都受到了显著损伤。结论丙炔苯丙胺可以通过激活PI3K/Akt和Erk两条激酶通路,促进Nrf2核转位发挥抗氧化效应,实现对MPP+导致PC12细胞损伤的保护作用。这种机制与丙炔苯丙胺对MAOB的抑制作用是并行的。
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