论文摘要
油茶是我国特色油料树种,主要栽培分布于南方丘陵酸性红壤地区。茶油因其品质优良而受到国家的高度重视。但是单位面积产量低一直是制约油茶产业快速发展的主要因素。油茶常规育种周期长,常规杂交育种可能伴有遗传累赘。采用分子设计育种新方法改良油茶,可实现单一性状或多个性状的定向改良,大大缩短育种周期,而且不会带有遗传累赘。糖酵解代谢途径是油茶种仁油脂合成的上游代谢途径,其代谢速率直接影响油茶种子油脂合成的效率。果糖1,6-二磷酸醛缩酶不仅是糖酵解代谢途径中的枢纽调控酶,也是油茶种子油脂合成的枢纽调控酶,还可以调控油茶的生殖生长。本文以国审油茶品种‘华硕’种仁为材料,通过构建数字化转录组和表达谱数据库,系统解析了油茶种仁糖酵解途径及其与油茶油脂合成和生殖生长的关系；克隆了4个油茶果糖1,6-二磷酸醛缩酶（CoFBA）家族基因；开展了该酶的亚细胞定位研究；分析了该基因表达与油茶种仁含油率等的关联性；构建了过表达载体和RNA干扰载体,转化野生型拟南芥和油菜,获得了T0代和T1代转基因植株。这些实验结果为油茶分子设计育种技术的开发应用奠定了一定的科学和技术基础。主要研究结果如下：1.油茶种仁糖酵解途径的分子生物学解析。以果实膨大期（6月）和油脂合成高峰期（10月）的油茶种仁为材料,建立了油茶种仁2个时期的合并转录组和2个不同时期数字化表达谱数据库。数据分析显示,油茶种仁糖酵解途径主要包含306条Unigene,分别归属于23类酶基因,即磷酸葡萄糖变位酶、葡萄糖-6-磷酸酶、葡糖磷酸异构酶、N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸-异构酶、二磷酸酯酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、丙糖磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二磷酸甘油酸变位酶、醛铁氧还蛋白还原酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、丙酮酸激酶、丙酮酸脱氢酶（硫辛酰胺）、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、L-乳酸脱氢酶、醛脱氢酶、乙醇脱氢酶、甲醇脱氢酶（细胞色素c）和乙醇脱氢酶（细胞色素c）。这些酶基因大部分为基因家族,其所包含的不同Unigene在油茶种仁发育的不同时期存在差异表达。油茶种仁表达谱糖酵解途径Pathway显著性富集分析结果显示：该代谢途径调控基因表达整体上调,由初期始样本表达量26（6月）上调至高峰期样本表达量336（10月）。根据油茶种仁转录组糖酵解/异生代谢途径Unigene数据分析和不同时期油茶种仁糖酵解代谢功能基因表达差异分析,总结绘制了油茶种仁糖酵解代谢调控途径。在分析过程中发现,转录组数据库中有11条CoFBA Unigene序列,其中有2条在油脂合成高峰期原始表达量是果实膨大期原始表达量的3-4倍,明显高于糖酵解途径中其他调控酶基因的表达量和变化幅度；油茶FBA从甘油代谢途径和脂肪代谢途径直接影响油茶种仁的油脂合成,是影响油茶油脂合成的关键酶之一。2.油茶FBA家族基因克隆及生物信息学分析。根据转录组分析数据,分别设计特异引物,采用RACE技术,逐一克隆了4个油茶FBA基因的全长cDNA序列,并在NCBI中注册,GenBank登录号分别为JN017093.1、JX914588、JX914589和JX914590。将该4个基因分别命名为CoFBA1、CoFBA2、CoFBA3和CoFBA4。生物信息学方法分析表明,这4个CoFBA基因均无信号肽,为亲水性蛋白,含有典型的1,6-二磷酸果糖醛缩酶活性结构,其中CoFBA1、CoFBA3和CoFBA4存在"VMFEGILLKPS"特异结构域,CoFBA2存在"VLLEGTLLKPN"特异结构域；CoFBA蛋白家族分为A、B两个亚族,CoFBA2归为B亚族,而CoFBA1、CoFBA3和CoFBA4归为A亚族,这意味着分化的先后多少与其活性位点、结构以及功能的差异是密切相关的。空间结构预测CoFBA1和CoFBA4与巴贝斯分枝杆菌1,6-二磷酸醛缩酶3kx6A结构相似,而CoFBA2和CoFBA3分别与兔肌肉醛缩酶31geB和恶性疟原虫二磷酸醛缩酶2pc4C结构相似。3.油茶FBA蛋白亚细胞定位研究。采用基因枪轰击洋葱表皮细胞法进行亚细胞定位分析,发现CoFBA并不单单定位于细胞质。结果显示,CoFBA1可能定位于细胞核,CoFBA2可能定位于细胞质,CoFBA3可能定位于周质,CoFBA4可能定位于细胞外,这些结果与生物信息学预测的外膜、细胞质、周质和外膜稍有差别。但无论是预测信息还是实验结果,都体现出CoFBA表达部位的多样性,而预测显示这4个醛缩酶均为非分泌性蛋白,如何转运到胞外,可能与其含有的肉豆蔻酰基化及糖基化位点有关。4.油茶FBA基因的表达对油茶种仁含油率的影响。油茶果实和种仁的表型特征能体现种仁含油率的差异,果实膨大期之前种皮乳白色,种仁白色,此时含油率仅10%左右,果实近成熟期种皮黑褐色,种仁油黄色,此时含油率升至50%左右。采用实时荧光定量PCR分析了8个不同发育时期油茶种仁中CoFBA1、CoFBA2、 CoFBA3和CoFBA4相对表达量,并对照比较了脂肪酸合成关键酶基因CoACP、 CoSAD和CoFAD2相对表达量,结合不同发育时期油茶种仁含油率的变化,采用灰色关联分析法,揭示其综合关联度分别为CoFBA1（0.762817）、CoFBA2（0.649344）、CoFBA3（0.672756）、CoFBA4（0.646704）,这与脂肪酸代谢关键酶基因的综合关联度CoACP （0.673442）、oSAD （0.699459）、CoFAD2（0.653404）相比差异不大,说明油茶种仁油脂合成不仅与脂肪酸代谢途径中各关键酶基因相关,而且糖酵解途径中关键酶基因也起到等同甚至更重要的影响。CoFBA基因家族表达调控对油茶种仁含油率具有一定的影响,通过调控CoFBA的表达在一定程度上有可能提高油茶的种仁含油率。5.超量表达载体和RNA干扰载体构建及遗传转化研究。构建了CoFBA1、 CoFBA1、和CoFBA4的过表达载体,CoFBA家族共抑制RNA干扰Gateway载体和对照用AtFBA家族RNA干扰Gateway载体,农杆菌介导转化哥伦比亚野生型拟南芥,筛选获得了T1代转基因拟南芥；采用Gateway技术构建CoFBA1过表达载体,农杆菌介导转化甘蓝型油菜,筛选获得了T1代‘自交15’转基因甘蓝型油菜,通过表型比较初步证实了CoFBA1促进生殖生长,提高结实率,从而提高产油率的生物学功能。